昆虫肠道是食物消化和营养物质吸收的主要部位，其中产生的消化酶，主要负责营养物质的消化吸收，有些也参与对病原微生物的免疫反应。食物中的蛋白质，在昆虫体内必须首先在肠道中经蛋白酶水解为游离氨基酸，才能被昆虫吸收并用于其生长发育。

柞蚕作为我国有经济价值的可食性昆虫，其蛋白质和不饱和脂肪酸含量高，有报道称其粗蛋白含量与鸡蛋相当。柞蚕蛋白质应该来自柞树叶蛋白质的转化。

金属羧肽酶M14家族成员在很多昆虫中被证实参与外源蛋白向内源蛋白的转化，然而柞蚕金属羧肽酶M14基因家族成员，还没有任何报道。

前期研究，在柞蚕肠道转录组数据中发现1个高表达的金属羧肽酶基因，本研究首先想克隆该基因的全长ORF序列，明确该基因的序列特征，为后续基因家族成员的鉴定提供参考。

柞蚕解剖和肠道总RNA的提取

柞蚕的解剖：选取野外饲养的生长正常的5龄柞蚕幼虫，带回实验室准备解剖。提前将剪刀、镊子、0.9%的生理盐水、玻璃平皿和吸水纸，在121℃的高压灭菌锅内灭菌。

将灭菌后的0.9%的生理盐水倒在玻璃平皿内并置于冰上，将柞蚕固定于泡沫板上，解剖并收集肠道组织，去掉内容物，将组织移至冰浴的0.9%的生理盐水中清洗，确保肠道内容物清洗干净后，放在灭菌后的吸水纸中吸干多余水分，分别装入提前标注好组织名称和日期的1.5mL无RNA酶离心管上，迅速放入液氮中速冻，随后放入-80℃冰箱中备用。

肠道总RNA的提取：提前将研钵、研磨杵和药匙洗干净并晾干，用铝箔包好后，在210℃的干热灭菌箱中灭菌4~6h。灭菌结束后，关闭仪器，待温度降至室温，取出待用。

在研钵中反复加入适量液氮提前预冷，并取出-80℃超低温冰箱里的柞蚕肠道组织样品置于液氮中，研钵预冷好后立即将组织样品置于研钵内迅速研磨，研磨过程中，随时补充液氮以保证液氮不完全挥发，直至样品充分研磨成粉末。

RNA的提取按照TotalRNAKitⅡ试剂盒进行抽提。本实验方法中提到的β-巯基乙醇、氯仿、无水乙醇、DEPC水等需自行准备。

RNA提取的方法如下：（1）提前在每1mL的裂解缓冲液（RNASolv®Reagent）中加入20μL的β-巯基乙醇，β-巯基乙醇有毒性，注意在通风橱中进行。用DEPC水提前配制好70%的乙醇备用。同时启动离心机，将离心机温度提前预冷至4℃。

（2）取30~80mg研磨好的粉末于1.5mL的提前预冷好的无RNA酶的离心管中，并加入1mL裂解缓冲液，充分涡旋混匀后室温静置5min。

（3）加入100~200μL的氯仿（在通风橱中进行），在涡旋振荡仪上高速震荡20s后室温静置3~5min，放入离心机中4℃，12,000×g离心15min。

（4）离心结束后，将上清液转移至新的1.5mL的无RNA酶的离心管中，注意不要吸到沉淀。上清液中加入等体积的70%的乙醇，涡旋混匀。

（5）将RNA结合柱套入收集管中，并将上一步所得的混合液转移至结合柱中（结合柱最大容量为700μL），将其放入离心机，10,000×g，1min，弃废液，并将结合柱放回收集管中。重复此步骤直至所有混合液被转移完。

（6）结合柱中加入500μLRNAWashBufferⅠ，10,000×g，30~60s，弃废液，将结合柱放回收集管中。

（7）结合柱中加入500μLRNAWashBufferⅡ，10,000×g，30~60s，弃废液，将结合柱放回收集管中。

（8）重复上一步骤，在弃掉收集管中滤液并装回结合柱后，放入离心机中10,000×g离心2min，尽量去除吸附柱中残留的无水乙醇。

（9）将结合柱放入一个新的无RNA酶的离心管中，在结合柱中央滴加45~75μL的DEPCWater洗脱RNA，静置2min后，将其放入离心机10,000×g离心2min，洗脱RNA。若想得到浓度更高的RNA，可将离心管中的RNA重新加入结合柱中，再次离心。离心完成后在离心管上标注好RNA名称和日期，-80℃保存备用。

RNA浓度和纯度的测定

RNA抽提完成后，用超微量紫外分光光度计检测RNA样品的浓度和纯度。首先用超纯水清洗探头，然后用DEPC水调零，直至NucleicAcidConc显示为0.0±0.1ng/μL。

用无RNA酶的枪头吸取1μL的RNA用于浓度测定，其A260/A280≥2.00为佳，说明RNA纯度较高。

若A260/A280比值低于2.0，说明存在蛋白质或酚类物质的影响。

琼脂糖凝胶电泳

溴化乙锭（Ethidiumbromide，EB）溶液：在专门配制EB溶液的瓶中，加入0.5g的溴化乙锭固体粉末，随后加入50mL的蒸馏水稀释并充分混匀，常温避光保存以备用。由于溴化乙锭具有剧毒，在配制过程中，注意佩戴好口罩和手套，做好防护。

琼脂糖凝胶的制备

实验常用的琼脂糖凝胶浓度为1%，具体制备方法如下：用天平称取1g的琼脂糖（Agarose）粉末，加入实验室制备琼脂糖凝胶专用的瓶中，同时量取100mL的提前稀释好的1×TAE缓冲液加入瓶中，适当摇匀后，放入微波炉中加热直至琼脂糖粉末完全溶解（注意加热的瓶子的瓶盖不能盖紧），加热时间一般需要1~2min。

加热完成后，拿出瓶子查看琼脂糖粉末的溶解情况，若没有完全溶解，轻晃摇匀后将瓶子重新放入微波炉中加热30~60s，直至琼脂糖完全溶解，完全溶解的液体呈透明状且没有固体颗粒残留。

加热完成后，会产生大量气泡，需轻晃至无气泡产生，室温放置使溶液温度降至50~60℃后，在溶液中加入1~2μL的提前配制好的EB溶液，轻晃混匀。

在溶液降温的同时，提前准备好所需的梳子、制胶板和制胶槽，并将其表面残留的凝胶冲洗干净，将制胶板放入制胶槽内，同时将梳子插入到制胶槽的固定位置，随后将混匀并降温的凝胶溶液倒入放置好的制胶器内，将制胶器水平放置在凝胶制备区域的实验台上，静置30min左右使凝胶自然凝固。

凝胶凝固后，轻轻垂直向上拔出梳子，取出制胶板，轻轻放入电泳槽内，电泳槽提前倒入电泳液（1×TAE缓冲液）。

整个制胶过程需佩戴一次性PE手套，加热和混匀时还需佩戴隔热线手套，防止污染和烫伤。

准备好后开始点样，将电泳样品缓缓加入样孔中，过程中防止戳破凝胶。

样品全部加完后，开始电泳，选择合适的电压和电流，可以选择恒压电泳（常用电压为100~200V），也可以选择恒流电泳（常用电流为120~200mA）。

抗生素溶液的配制

氨苄青霉素（Amp+）：称取5g的氨苄青霉素粉末于50mL的灭菌后的容量瓶中，缓慢加入ddH2O使粉末充分溶解，定容至50mL。

在超净台中，用孔径为0.22μm的滤器过滤除菌，将过滤后的氨苄青霉素溶液分装到经高压灭菌后的1.5mL的离心管中，管盖上标注好名称和日期，-20℃保存备用。

卡那霉素（Kan+）：称取0.5g的粉末状的硫酸卡那霉素于50mL的灭菌后的容量瓶中，缓慢加入ddH2O使粉末充分溶解，定容至50mL。

在超净台中，用孔径为0.22μm的滤器过滤除菌，将过滤后的卡那霉素溶液分装到经高压灭菌后的1.5mL的离心管中，管盖上标注好名称和日期，-20℃保存备用。

细菌培养用LB培养基的配制方法

液体LB培养基：根据实验需要，可配制不同体积的LB培养基。

如需配制300mL的LB液体培养，则称取1.5g酵母提取物（Yeastextract），3g胰蛋白胨（Tryptone），3g氯化钠，倒入三角锥形瓶或蓝盖瓶中，加入300mL的蒸馏水后，用铝箔纸和牛皮纸封口（蓝盖瓶的旋盖需松开两圈），121℃高压蒸汽灭菌3h，灭菌结束后取出，蓝盖瓶旋盖及时旋紧，室温放置或4℃保存备用。

在液体培养基中加入实验所需的抗生素后，可制备对应抗性的液体培养基，同样4℃保存。

固体LB培养基：如需配制300mL的LB固体培养基，则称取1.5g酵母提取物（Yeastextract），3g胰蛋白胨（Tryptone），3g氯化钠，倒入三角锥形瓶中，加入300mL的蒸馏水后，用铝箔纸和牛皮纸封口，121℃高压蒸汽灭菌3h取出。

室温放置至50℃左右后，在提前经紫外照射的超净台中，将培养基倒入灭菌后的玻璃平皿中（注意倒入的培养基的厚度），待培养基凝固后，用封口膜封口，标注为无抗性的LB固体培养基，标注好日期后，4℃保存。

若是制备有抗性的固体LB平板培养基，则在培养基降温至50℃左右时，加入1:1000体积的相应抗生素，摇匀后迅速倒入玻璃平皿中，防止倒入的过程中培养基凝固。

细菌转化实验

（1）超净台提前经紫外线照射30min左右。从-80℃冰箱中取出感受态细胞（100μL）迅速置于冰上，在超净工作台中加入连接产物（5μL）后迅速置于冰上静置30min。

（2）在42℃水浴锅中热激60~90s，迅速置于冰上2min。

（3）加入500μL的无抗性的LB液体培养基，于37℃摇床220rpm震荡培养45~60min。

（4）3,000rpm离心5min，吸除250μL的上清液，用枪头吹打使沉淀与剩余上清液充分混匀，吸取80~100μL菌液涂布到含有氨苄青霉素（Amp+）的固体LB平板上，封口膜封口后，倒置于37℃培养箱培养12h（过夜培养）。

菌液的保存（保菌）：提前将甘油和1.5mL的离心管放入高压蒸汽灭菌锅灭菌，在超净工作台中将600μL的过夜培养的菌液和300μL的甘油加入到离心管中，并涡旋混匀，标注好菌液名称和日期，置于-80℃冰箱中保存。

ApMCP1基因的克隆

首先扩增ApMCP1基因的中间片段。根据该基因现有的序列，使用PrimerPremier5软件设计引物（表2-1），并送生物公司合成。以稀释后的（一般稀释10倍）柞蚕肠道cDNA为模板，进行RT-PCR。

PCR的扩增体系为：酶2×EasyTaq®PCRSuperMix6μL，上游引物ApMCP1-F0.5μL，下游引物ApMCP1-R0.5μL，模板1μL，ddH2O4μL，反应体系的总体积为12μL。

其中，5′末端RACE反应步骤：（1）首先对提取的柞蚕肠道总RNA样品进行特殊处理。

（2）使用LigatedRNA和本小组设计的RACE克隆专用的特异引物Oligo（dT）60进行反转录反应，cDNA的合成方法根据2.1.3中的方法进行。

（3）5′末端RACE反应需进行两轮PCR，第一轮PCR以5′RACE第一链cDNA为模板，扩增体系为：2×TaqPlusMasterMixII6μL，5′RACEOuterPrimer0.5μL，5raceApMCP1-R10.5μL，模板2μL，ddH2O3μL，反应体系的总体积为12μL。

PCR反应程序为：预变性：95℃5min变性：95℃30s退火：50℃40s30个循环延伸：72℃90s终延伸：72℃5min

第一轮PCR反应程序结束后，将PCR产物稀释100倍后，作为模板进行第二轮PCR反应，反应体系的扩增体系为2×TaqPlusMasterMixII12.5μL，5′race-25nest0.5μL，5raceApMCP1-R20.5μL，模板2μL，ddH2O9.5μL，反应体系的总体积为25μL，PCR反应程序同第一轮PCR反应一样（退火温度改为57℃）。

反应程序结束后，取5μL点样，琼脂糖凝胶电泳后使用凝胶成像系统进行拍照检测，若有条带且正确，则将对应的剩余PCR产物纯化回收，连接到pEASY®-T1Simple克隆载体上（反应体系和反应条件同上）。

将连接产物转化到配制好的感受态细胞中，涂布到有氨苄青霉素（Amp+）抗性的固体LB平板上，倒置于37℃培养箱中培养12h（过夜培养）。

第二天挑菌后，吸取2μL菌液作为模板于PCR反应体系中，进行PCR筛选验证，PCR验证为阳性的菌液，吸取5μL于5mL的LB（Amp+抗性）液体培养基中扩大培养（过夜摇菌），第二天吸取1mL菌液寄送生物公司测序，剩余菌液置于4℃保存。

测序结果即为该基因克隆的5′末端片段序列。

ApMCP1基因的序列分析

通过BLASTN2.11.0+[68]将ApMCP1基因的核苷酸序列与柞蚕基因组[69]进行本地比对，分析该基因的基因结构。

结果与分析

羧肽酶中研究较多的就是金属羧肽酶，且家族种类多。金属羧肽酶M14基因家族成员在柞蚕中还未被鉴定，因此将该基因命名为ApMCP1，方便进一步研究。消化酶相关基因。

在蓝色圆点所示的肠道高表达基因中，其中一个基因（红色圆点）在柞蚕基因组中被注释为金属羧肽酶M14基因，对应在柞蚕基因组中的登录号为GWHGABGR015514。

羧肽酶中研究较多的就是金属羧肽酶，且家族种类多。金属羧肽酶M14基因家族成员在柞蚕中还未被鉴定，因此将该基因命名为ApMCP1，方便进一步研究。

因的中间片段，大约850bp左右，同时可以确定ApMCP1确实在肠道中表达。将纯化后的产物与T载连接转化后，通过菌落PCR筛选阳性克隆，测序后得到833bp的中间片段。

将测序得到的中间片段、5′末端序列及转录组组装转录本进行比对拼接，发现测序的序列和转录组组装序列完全吻合。

因此将扩增的中间片段序列、克隆得到的5′末端序列整理拼接到组装好的ApMCP1转录本序列中，得到ApMCP1的全长ORF序列。转录组组装序列和RT-PCR、5′RACE的测序序列的比较。

根据ApMCP1的锌结合位点（H69SRE72…H196），可以得知ApMCP1基因属于M14A亚家族成员。