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颞叶癫痫 (TLE) 是成人中最常见的 耐药性癫痫 形式，经常伴有 致残性神经精神和认知合并症 ，癫痫患者通常需要服用多种 抗癫痫药物 (ASM) ，以控制癫痫发作，但目前尚无具有持久效果的药物缓解疾病疗法，可以减轻 慢性颞叶癫痫 (TLE) 的癫痫发作和合并症。
本研究中，我们评估 硒酸钠 治疗对 耐药 TLE 慢性癫痫大鼠癫痫持续状态 (SE) 模型的疾病 缓解作用 ，主要为了对死后脑组织进行靶向和非靶向蛋白质组学和代谢组学，以确定与改变疾病结果相关的潜在途径。
实验最终目的是为了 证明硒酸钠治疗与疾病严重程度的缓解有关 ，从而进一步的减少自发性癫痫发作（p<0.05）、认知功能障碍（p<0.05）和感觉运动缺陷（p<0.01）的次数。
我们确信硒酸钠治疗可对 TLE KA SE 后模型中的慢性癫痫大鼠产生持续的疾病缓解作用， 包括改善共病学习和记忆缺陷 。
一、佐证及实操方案
1.1改良红藻氨酸诱导的癫痫持续状态
我们将大鼠单独圈养，光照和黑暗周期交替 12 小时（灯在 07:00 点亮），整个研究期间随意提供食物和水，使用重复低剂量 KA 给药方案，给大鼠腹腔注射初始剂量 KA 7.5 mg/kg，根据拉辛量表（Racine，1972）监测大鼠的行为癫痫发作。
如果在至少五次拉辛五级癫痫发作中没有观察到连续癫痫发作活动，则再腹腔注射 5 mg/kg 剂量，给予 2.5 mg/kg 剂量的 KA，最高剂量为 20 mg/kg，假设大鼠在最大 KA 剂量后未表现出稳定的自我维持 SE，则从实验中剔除。
另一手术组的处理方式相同，但注射的是盐水而不是 KA，持续 SE 4 小时后，通过视觉确认行为癫痫发作进行评估，给予大鼠*西泮地**（5 毫克/千克/剂）以停止。
1.2脑电图电极植入手术
实验诱导 SE 九周后，用异氟烷麻醉大鼠，并在无菌技术下进行脑电图手术，在颅骨上钻四个钻孔，但不穿透硬脑膜，额顶区域每侧各一个（AP：± 1.7；ML：–2.5），颞区每侧各两个（AP：± 5. 6；ML ：左 2.5）。
在 lambda 之前，将四个硬膜外不锈钢螺钉记录电极拧入毛刺孔中，接地电极和参考电极植入小脑上方顶骨的每一侧，并使用牙科水泥在电极周围和头骨上进行固定，使用丁丙诺啡（0.05 mg/kg，Indivior Australia）作为镇痛剂。
SE 诱导十周后，使用电缆连接大鼠，vEEG 记录使用 Profusion 3 软件采集，未过滤并以 512 Hz 数字化。
1.3治疗前癫痫发作分析筛查
我们选择使用半自动癫痫发作检测软件 Assyst，对所有 vEEG 记录进行癫痫发作筛查，使用 Profusion 3 软件对癫痫发作事件进行目视确认。
因为癫痫发作定义为有节律性尖峰活动的发作，其幅度为基线幅度的三倍，且频率>3 Hz，持续至少10秒，癫痫发作结束被确定为最后一个峰值。
通过分析每天平均癫痫发作次数、平均癫痫发作持续时间和癫痫发作类别（即严重程度、拉辛量表），发现在基线视频脑电图（vEEG）一周内没有两次或多次癫痫发作的大鼠被从实验中丢弃。
在治疗前，癫痫发作筛选周期间发生癫痫发作的 SE 后大鼠被随机分配到四个治疗组之一： SE 后 + 媒介物 (n = 12) 、 SE 后 + 硒酸钠 (n = 12) 、 SE 后 + 左乙拉西坦 (n=12) 。
皮下渗透泵输送 硒酸钠、左乙拉西坦 或 载体 （盐水 0.9%）被植入并 持续治疗四个星期，硒酸钠 和 左乙拉西坦 的剂量是根据以前的研究选择的。
而 SPT 是一种经过充分验证大鼠 抑郁/快感缺乏 的测量方法，用于评估治疗对改变 SE 后大鼠的抑郁样行为的效果，蔗糖偏好计算为消耗的蔗糖溶液占总体积的百分比，测试期间，这些大鼠仍留在同一个笼子里。
试验开始前一小时，给予大鼠 0.5ml的试验2％蔗糖 ，以确保大鼠饮用蔗糖溶液，向大鼠提供两个瓶子，一个装满水，另一个装满 2% 蔗糖水溶液，持续 24 小时，瓶子位置是随机的， 以避免位置偏好 ，记录总液体摄入量和对蔗糖的偏好百分比。
为了评估治疗不同的疾病缓解效果，大鼠在治疗的第二周和第四周以及清洗后的第四周和第八周接受了 连续 7 天的 vEEG 记录 ，选择八周的清除期是为了长期监测治疗的疾病缓解效果，仅考虑出现 自发性癫痫发作 的大鼠的癫痫发作持续时间和类别。
最后一次行为测试 7 天后，使用 5% 异氟烷麻醉大鼠，并使用致死剂量的腹腔注射 Lethabarb进行扑杀，从每只大鼠的耳朵中取出组织并保存在 -80 °C 下进行端粒长度 (TL) 分析（Hehar 和 Mychasiuk）。
使用大鼠脑图谱作为参考（Paxinos 和 Watson），快速解剖每个治疗组（n=3）大鼠的海马体和体感皮层，用液氮快速冷冻，并保存在 -80°C以下用于非靶向蛋白质组学、代谢组学和蛋白质印迹研究。
二、蛋白质组学和代谢组学数据分析
我们将用硒酸盐、左乙拉西坦、媒介物和假手术治疗的大鼠的体感皮层和海马的蛋白质组学和代谢组学质谱数据制成光谱峰值强度值，然后进行 log2 转换和单位方差缩放，通过用背景信号替换缺失值来省略它们。
采用单向方差分析和 Tukey's HSD 来确定左乙拉西坦、硒酸盐、媒介物和假手术组之间代谢物和蛋白质丰度的差异，FDR <0.05 的错误发现率被认为是显着的，除了单变量分析之外，还进行了主成分分析 (PCA) 和偏最小二乘判别分析 (PLS-DA) 形式的多变量分析，以识别驱动治疗组之间分离的代谢物和蛋白质。
通过 MetaboAnalyst 5.0 网络工具的定量富集模块在所有组对之间进行代谢物集富集分析，用于代谢组数据， Reactome 可以基于网络的工具对蛋白质组学工具的重叠基因权重降低的路径分析 (PADOG) 模块，在所有治疗组对之间进行定量基因集富集分析数据。
PADOG 是一种加权基因/蛋白质集分析方法，可降低许多途径中存在的基因/蛋白质的权重，从而防止其重要性被夸大，FDR <0.05 的通路被认为是差异调节的。
三、多组学相关网络分析、模块检测和功能注释
我们采用早期积分和加权相关网络分析的方法来表征SE大鼠的蛋白质组和代谢组，构建了基于相关性的蛋白质和代谢物网络，然后将其聚类成模块并通过通路富集分析进行功能注释。
为了整合蛋白质组和代谢组数据进行网络分析，我们对标准化的蛋白质组和代谢组数据进行单位方差缩放并将其连接到单个矩阵中，单位方差缩放使用标准差作为缩放因子，可以根据相关性对所得综合数据进行分析，通过使用 WGCNA R 包的 WGCNA 框架，为所有治疗组构建基于相关性的多组学网络。
相当于构建了一个邻接矩阵，反映所有样本中所有检测到的蛋白质和代谢物之间的成对皮尔逊相关性，基于邻接矩阵构建相关网络，其中每个节点对应于单个代谢物或蛋白质，节点之间的边代表所有样本中给代谢物/蛋白质的相对丰度之间的相关性。
采用聚类算法来识别代谢物/蛋白质模块，通过联合途径富集分析对其进行功能注释构成每个模块的所有代谢物/蛋白质，除了独特的颜色标签外，每个模块还通过基于功能富集分析的代表性生物途径进行标记，检查模块与临床特征（例如平均癫痫发作类别、端粒长度和认知能力）的 Spearman 相关性。
四、使用自动毛细管蛋白质印迹进行靶向蛋白质表达
为了证明毛细管蛋白质印迹用于评估过度磷酸化 tau (h-tau)、总 tau 和 PP2A 的蛋白表达，将一部分冷冻体感皮层/组织内含有蛋白酶和磷酸酶*制剂抑**的放射免疫沉淀测定，缓冲液中均质化裂解物的蛋白质浓度使用 BCA 蛋白测定试剂盒和 Benchmark Plus 微孔板分光光度计进行定量。
根据使用 Wes Protein Simple Western 系统进行毛细管蛋白质印迹分析，对总 tau 蛋白进行单独测定和甘油醛 3-磷酸脱氢酶用作上样对照，H-tau 被确定为磷酸化 tau (AT8) 相对于总 tau (tau 5) 的比率，原始数据或数据表示为对照平均值的百分比。
基于我们之前 KA 诱导的 SE 后大鼠研究进行的功效分析表明，每组需要 n=8 才能检测到 30% 的差异考虑α = 0.05 且功效 = 95%，治疗组之间的差异，对于多组学实验，每组至少使用 n=3 只大鼠。
结论
在这项研究中，我们 证明了硒酸钠治疗在大鼠模型中有持久缓解疾病和药物治疗作用 ，可以减轻已形成的癫痫状态，并减少癫痫发作和认知合并症的频率。
为此我们还分析了耳部活检的端粒长度，因为之前的证据表明大脑和外周皮肤细胞的端粒长度之间存在很强的相关性，我们发现用 赋形剂 或 左乙拉西坦 治疗的 TLE 大鼠 的端粒长度显着缩短， 而用硒酸钠治疗的大鼠则具有更长的端粒 。
在我们的耐药 TLE 模型中， 端粒长度缩短的程度与癫痫发作次数和更明显的认知缺陷密切相关 ，数据强调了端粒长度作为疾病严重程度、治疗反应和 TLE 疾病修饰 的预后生物标志物的潜力，有可能用于 DMT 的进一步试验。
未来的研究应结合在不同时间点对脑组织和生物液体（血液和脑脊液）进行的 多组学和端粒长度分析整合 ，以绘制出该模型中癫痫的发生、进展和治疗反应。
这种方法可以帮助我们加深对硒酸钠作为疾病缓解治疗已确定的耐药性 TLE 的作用机制的理解，而这项研究的结果如果在临床试验中得到证实， 可能会改变这种常见且高度致残疾病的治疗范式 。
参考文献
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