前沿
随着基因载体的完善、嵌合抗原受体T细胞免疫治疗（CAR-T）的兴起以及基因组编辑技术的突破，基因治疗再次回到了疾病治疗的中心阶段。它为肿瘤、遗传性疾病等疾病的临床治疗带来了新的选择，改变了单基因疾病和细胞淋巴瘤的治疗现状。截至2019年8月，已有22种基因治疗药物获得了各国药品监管机构的批准。中国第一次基因治疗临床试验始于1991年，CRISPR的首个临床试验也在中国进行，如图1所示。自20世纪80年代以来，基因治疗逐渐被政府和公众所接受，并在过去的几年里成为了一种重要的人类疾病治疗方法。因此，基因治疗药物凭借安全的载体和先进的生物技术，将在未来人类疾病的防治中发挥更大的作用。
图1|中国基因治疗的里程碑事件（来源：Gene Ther）
基因治疗的概念
基因治疗是将正常功能的外源基因导入靶细胞，以置换或增补异常和缺陷的基因 ，从而达到治疗疾病的目的。或者将某些遗传物质转移到患者体内，使其在体内进行表达，最终达到治疗某种疾病的方法。基因治疗的核心就是将正常基因或者有治疗作用的基因通过一定的方法导入到人体内以纠正基因缺陷发挥其治疗作用，从而达到治疗疾病的目的。目前的基因治疗技术还不成熟，除了有效性外，安全性、伦理问题等都在无形中阻碍了基因治疗前进的脚步。而目前开展的基因治疗只限于T细胞，主要治疗眼科疾病、遗传病、心血管疾病、感染性疾病、肿瘤等。
基因治疗的机制
基因治疗通常包括3种基本策略：基因转移、基因沉默以及基因编辑。
基因转移是将外源基因导入病变细胞或者其它细胞，其表达产物能够修饰缺陷细胞的功能或者使原有的某些功能得以加强，是目前已上市和实验中的基因疗法最主要的作用原理之一。基因转移适用于获得性疾病，增加参与其中的特定蛋白质的量可以合理预期该疾病的发病机理，减弱临床表现。基因转移也可用于治疗遗传性疾病，在这些疾病中，致病突变降低了蛋白质的生理功能，破坏了其氨基酸序列，或大幅降低了蛋白表达，如图2所示。
图2|基因转移|这种方法用于治疗突变和/或环境因素影响蛋白质生理功能或大幅降低其表达的疾病
基因沉默是利用核酸技术或者基因敲除技术特异性的将基因封闭，抑制有害基因的表达，如RNAi、反义RNA或者核酶等技术。基因沉默可以用于治疗由功能获得性突变引起的常染色体显性遗传疾病。 这种先进而复杂的方法还面临着另一个挑战，即在保持野生型等位基因表达不变的同时，又有足够的选择权来沉默突变的等位基因，如图3所示。
图3|基因沉默（来源：Nat Rev Cardiol）
基因编辑是一种新兴的基因工程技术，可以定点编辑想要编辑的基因，实现特定DN*片A**段或者特定DNA碱基的加入、删除、替换等，以改变目的基因或调控元件的序列、表达量或者功能。其基本原理是通过称为“分子剪刀”的核酸酶在基因组特定位点产生位点特异性双链断裂（DSB），促使机体通过同源重组（HR）或者非同源末端连接（NHEJ）方式对DSB进行修复，从而实现基因的定向编辑。
近年来，多种靶向核酸内切酶技术蜂拥而至，从巨型核酸酶(Meganuclease)、锌指核酸酶(ZFNs)的发现到转录激活样效应因子核酸酶(TALEN)，再到目前突破性进展的成簇规律间隔短回文重复(CRISPR/Cas9)系统，如图4所示。基因编辑技术得到广泛应用和飞速发展，目前基因编辑技术已经在肿瘤、感染性疾病、多种单基因遗传病等的基因治疗上得到有效应用。
图4|基因编辑的工具（来源：Nat Rev Neurol）
基因治疗的分类
基因治疗的最终目的是使正常基因在患者体内高效、持久稳定地表达。基因治疗大体分为体内和体外两种途径。体内途径是将基因通过载体导入患者的体细胞中进行基因修饰，其主要步骤首先获取制备目的基因，构建目的基因-载体复合物，将载体复合物导入人体中。体内基因治疗的一个例子是治疗因RPE65的功能变异而导致的视力丧失，RPE65编码一种酶，该酶将全反式视黄酯转化为11-顺式视黄醇，这是视网膜色素上皮中发生的视觉周期的一部分。首先将该基因构建到腺病毒(AAV)中；其次，重组AAV病毒纯化、消毒后注射到患者神经视网膜下；最后，RPE65 DNA进入细胞核，最后经过转录翻译表达RPE65蛋白，从而恢复视觉功能，如图5所示。2017年，美国FDA批准了一种基因治疗产品LuxturnaTM，该产品就是用于治疗由RPE65基因突变引起的遗传性视网膜疾病。
图5|基因治疗的体内传递（来源：N Engl J Med）
体外途径是将细胞在体外经过改造后输回患者体内，其主要步骤首先分离患者体细胞进行培养，通过载体或者物理方法将治疗基因导入培养的细胞，筛选成功转化的细胞并进行培养增殖，然后将改造好的细胞重新输回患者体内，以达到治疗的效果。基因治疗的体外传递的一个例子是β-地中海贫血的治疗。其基本流程是从患者的骨髓或外周血中收集、分离细胞，使用慢病毒载体将正常的β-珠蛋白基因导入其中，使细胞功能恢复正常，最后将改造后的造血干细胞回输给患者， 如图6所示。
图6|基因治疗的体外传递（来源：N Engl J Med）
体内转导途径不需要对器官组织进行改造，但由于机体体积大、体液环境复杂等情况，仍旧存在转染效率低且不宜控制等缺点。体外途径的优势在于可以对难转染的细胞进行筛选提高其转染效率，同时外源基因可以直接作用于细胞中的染色体上，能够长期稳定表达，并伴随着细胞分裂遗传给子细胞。
基因治疗所面临的问题
目前，基因治疗也面临着诸多问题。大多数的临床基因治疗策略都使用了病毒载体，但是病毒自身仍旧不可避免的带来一些安全隐患，一方面病毒载体自身的免疫原性可能会引起机体的免疫反应，另一方面病毒携带的遗传物质可能随机整合或者激活原癌基因导致细胞异常增殖。尽管目前大都采用的是免疫原性及安全隐患大大降低的AAV，但是彻底消灭病毒载体的毒性或者寻求其他的替代载体降低其免疫原性是未来研究的重中之重。基因编辑存在脱靶效应，一旦在重要功能基因上发生脱靶效应将造成非常严重的后果，因此在进行基因编辑的过程中深度测序是非常有必要的。CAR-T技术无疑为癌症的治疗带来新的希望，然而这种疗法有非常严重的不良反应，主要引起机体发生细胞因子释放风暴，重症细胞因子释放风暴将会引起全身炎症，如不及时处理可能会危及生命。
基因治疗除了存在安全性问题之外，其伦理问题引发社会广泛的讨论。2018年11月26日，南方科技大学副教授贺建奎对外宣称，一对名为露露和娜娜的基因编辑婴儿于本月在中国健康诞生，他们对双胞胎的一个基因（CCR5）进行编辑，从而使她们出生后即能天然抵抗艾滋病病毒。消息一出便激起轩然大波，引发了大众对科学伦理与研究安全性的担忧。今后的基因治疗发展，需要更加严格的监管制度来规范在体细胞和生殖细胞上的基因治疗探索。
总结
基因治疗为无数患者带来了希望。尽管一些基因治疗应用已经初见成效，基因治疗的安全性和有效性仍旧是科研工作者不懈努力的方向。随着基因编辑技术的兴起，越来越多的基因产品获批上市。不难想象，在不久的将来，基因治疗将占据疾病治疗的“C位”，让我们拭目以待。
参考文献
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