文 |2号生活馆
编辑 |2号生活馆
引言
在肉鸡养殖中，弯曲杆菌（Campylobacter）是一种常见的食品安全和公共卫生问题，其与食品污染和食源性疾病的发生密切相关，本文研究的目的是通过在肉鸡生产的不同阶段应用噬菌体，旨在评估其对弯曲杆菌数量的影响，以及其是否能够有效地减少弯曲杆菌在肉鸡生产链中的传播。
研究表明，在不同阶段应用噬菌体可能显示出一定的控制效果，噬菌体可能与弯曲杆菌发生特异性的宿主-寄主关系，导致弯曲杆菌数量的降低，需要注意的是，弯曲杆菌对噬菌体的抗药性可能会在一定程度上影响其控制效果，噬菌体的特异性需要进一步研究，以克服可能的抗药性问题。
噬菌体选择
在本研究中，我们选取了作为噬菌体宿主的三株弯曲杆菌，分别为空肠梭菌NCTC 12662，空肠梭菌NC3142和大肠杆菌NC2934，这些菌株在血琼脂2号培养基中，添加了5%马血裂解物，在微需氧条件下，以42°C、24小时的温度下生长，使用Campygen气包进行培养。
用于抗性测试的分离物来自研究开始前和研究后的鸡切卡和胴体，在2012年至2015年期间，我们从盲肠内容物、垫料、尸体冲洗液以及肉鸡场和猪废水的土壤样本中分离出噬菌体，为了直接从盲肠内容物中分离噬菌体，我们在SM缓冲液中添加了10%的悬浮液。
在4°C下孵育过夜，然后在15°C下以000，10g离心4分钟，通过0.2μm过滤器过滤，接着，加入100μl含有200μl弯曲杆菌宿主菌株，并在42°C下孵育30分钟，以促使噬菌体与宿主结合，样本与肉汤的比例如下：盲肠含量与猪流出物为1：4；垃圾为1：6；土壤为1：3；尸体冲洗为1：2。
我们将悬浮液加入到5ml熔化的0.6%NZCYM软琼脂覆盖层中，在48°C下，倒入1%NZCYM平板上并使其凝固，然后将板干燥，盖子部分打开，然后在微需氧条件下在42°C下孵育24小时，以便进行噬菌体分离，我们使用移液器吸头收集分离的斑块并悬浮在100μl的SM缓冲液中，每个单独的斑块都进行了三次繁殖，以确保分离株代表单个克隆。
此外，我们还采用了改良的普雷斯顿肉汤富集技术，普雷斯顿基础肉汤由2号营养肉汤和5%LHB组成，其中还添加了弯曲杆菌生长补充剂和Preston弯曲杆菌选择性补充剂，我们通过添加10 mM MgSO4和1 mM氯化镓来改进肉汤，以进行噬菌体富集。
我们将过夜培养物中的空肠梭菌NCTC 12662、空肠梭菌NC3142和大肠杆菌NC2934加入稀释的样品中，随后，在微需氧条件下，以24°C、600小时的温度孵育富集肉汤中的样品和宿主细菌，经过孵育、离心和过滤后，我们使用上述的软琼脂技术对噬菌体进行了直接分离，将所有三个宿主分别放置在不同的平板上。
我们使用了多种组合，从600个弯曲杆菌分离株中筛选出了486个噬菌体，以便从中选出代表性的19个成员噬菌体，此外，还根据其裂解活性，将来自养猪场废水的另外两株噬菌体纳入研究，最终得到了一个由17个成员组成的噬菌体鸡尾酒候选小组，我们使用的弯曲杆菌分离株代表了来自东南部36个农场的空肠衣原体和大肠杆菌的混合物。
候选物筛选与农场试验
我们对19种噬菌体鸡尾酒候选物的裂解活性进行了测试，并与2012年至2016年间从州九个不同农场分离的2016种代表性弯曲杆菌分离株进行了对比，我们将稀释后含有106 PFU/ml的19种噬菌体鸡尾酒候选物分布到先前制备的测试细菌草坪上，在孵育后，如果观察到透明或半透明的裂解区域，则表示该菌株对噬菌体敏感。
在生长周期结束前约1周，我们对六个具有大致相同年龄的鸟类农场进行了预先筛选，我们从每个农场的两到四个棚中随机挑选了三只鸡进行筛选，我们选择的标准包括农场具有高水平的常驻弯曲杆菌种群，该种群对19种选定的噬菌体候选者中的至少一种敏感，并且消化样本对本地噬菌体呈阴性。
我们将本土噬菌体视为先决条件，因为以前的研究表明，这些噬菌体可能会影响弯曲杆菌种群，在安乐死后，我们将鸟类的ceca在3-4小室内取出，并在冰上运输到实验室，对于弯曲杆菌计数。
我们制备了盲肠内容物的连续稀释液，并将每种稀释液的100μl均匀涂布在含有选择性补充剂的mCCDA平板上，在微需氧条件下在37°C下孵育48小时，我们从每个棚子中随机挑选出表现良好的弯曲杆菌菌落，并进行重新划线以获得纯度，然后，我们使用19种噬菌体混合物候选物对它们的裂解曲线进行了评估，如前文所述。
我们从符合三个标准的两个农场中选择了最合适的噬菌体，形成了鸡尾酒，用于这些农场的测试鸡，这些标准包括农场A的PH5、PH8、PH11和PH13，以及农场B的PH18和PH19，在试验期间，我们使用了两个测试鸡舍场和特定条件。
在每个选定的农场中，我们将两组随机挑选的30只鸟分成两个围栏，在鸡舍内使用金属丝网，但其他养殖条件与谷仓其他部分相同，此时，所有鸟类均为47天大，通过口服强饲法，在运送到加工厂前的一天，我们分别给予噬菌体处理组每种噬菌体的107 PFU/ml3毫升，给予安慰剂组3毫升无菌自来水。
按照正常的农场实践，收集前8小时取走食物和水，第二天，当主要队列被收集到加工厂时，每组10只鸟在农场进行安乐死，另外10只鸟在运送后被安乐死，最后一组尸体在氯冲洗之前由植物处理并收集。
农场到工厂的肠道内容物计数
所选的19种噬菌体鸡尾酒候选物展现了对农场弯曲杆菌分离株裂解活性的多样性，在对比的241株猪场弯曲杆菌分离株中，有200株被鉴定为空肠衣原体，39株为大肠杆菌，而有78株无法明确归类为某一物种，有<>株弯曲杆菌菌株对至少一种噬菌体鸡尾酒成员表现出敏感性。
这些分析显示，噬菌体PH18和PH19展现了最为广泛的裂解活性，尽管对大多数空肠衣原体菌株都有效，但似乎对大肠杆菌更具有效性，相比之下，其他噬菌体如PH1、PH7、PH19和PH17在多种空肠衣原体菌株中表现出活性，但对测试的大肠杆菌分离株没有裂解作用。
对于测试的10种分离株，它们的裂解谱各自相似，这表明在饲养周期的某个时段内，某一种弯曲杆菌类型占主导地位，所有来自这六个猪场的分离株都代表了空肠衣原体和大肠衣原体，其中空肠衣原体占据主导地位，在所有六个猪场中，弯曲杆菌的标准得到满足，其范围从107.00到9.00 CFU/g对数级。
在农场A中，所有10个分离株对19个候选噬菌体中的13个敏感，只有一个噬菌体没有表现出活性，从农场A试验中，选择了噬菌体PH5、PH8、PH11和PH13，对于农场B，噬菌体PH1至PH17对10种测试分离株均无效，但所有分离株对PH18和PH19表现出敏感性，因此选择了这两种噬菌体用于农场B的试验。
我们对鸟类盲肠和回肠样品进行了弯曲杆菌和噬菌体的计数，但由于弯曲杆菌选择性培养基上高水平的竞争菌群，仅从农场B的加工尸体中计数出了噬菌体，与来自盲肠的弯曲杆菌计数相比，对照日志中的CFU/g计数为10，噬菌体处理鸟类的计数在农场A中不呈正态分布。
对照的中位数为6.91对数10CFU/g，与噬菌体处理鸟类的5.79对数10CFU/g进行了比较，非参数分析显示，噬菌体处理的盲肠弯曲杆菌计数显著低于对照组，通过参考24小时重复计数数据和记录的禽类噬菌体滴度，数据中的异常值8.36对数10CFU/g被确认并纳入分析，盲肠弯曲杆菌计数得到确认并在分析中包括。
但值得注意的是，样本的噬菌体滴度记录最低，这可能代表在处理期间噬菌体未能有效复制的情况，在运送到工厂后，噬菌体处理和对照组鸟类的弯曲杆菌计数之间没有显著差异，尽管对照组的中位数更高，为7.39对数10CFU/g。
与噬菌体处理鸟类的6.49对数10CFU/g进行比较，通过Spearman秩相关系数分析，治疗鸟类的弯曲杆菌计数与噬菌体滴度之间存在着明显的负相关关系，如预期，来自农场A的对照鸟中未检测到噬菌体，对于噬菌体处理的鸟类，农场和工厂之间无显著差异，其中位数分别为5.6和5.0对数10PFU/g盲肠内容物。
结论
研究结果表明，噬菌体可能在整个肉鸡生产链中发挥一定的控制作用，从农场到加工厂，噬菌体可能随着肉鸡的传递而减少弯曲杆菌数量，从而减少食品污染的潜在风险，但噬菌体的应用需要考虑其安全性，以确保不对人类和环境造成负面影响，对于食品安全和环境风险的评估是必要的。
参考文献：
伊加尔维斯克，《弯曲杆菌噬菌体与肉鸡盲肠宿主存在减少的相关性》
库萨德，《针对靶弯曲杆菌菌株的噬菌体分离方法》
布里克罗德，《肉鸡空肠弯曲杆菌噬菌体及其宿主的纵向研究》