记得刚来实验室开始做 Western Blot ，因为步骤多，时间长，加上中间空闲时间多还要抓紧做其他实验或者看文献，简直像一场马拉松比赛，非常非常考验耐心和细心，稍不用注意就手忙脚乱，忘这忘那，时间浪费了不说，还可能浪费珍贵的蛋白样本和昂贵的抗体。
因此，小编贴心的提供一份简易的 Western Blot 操作指南 ，帮你规划时间，争取在一天内跑完样品拿到结果，安心 回去睡觉 继续看文献，很适合新手学习和收藏哦~
前期准备
蛋白已经定量，各样本已经稀释到某固定浓度，已经和 SDS loading buffer 混合，已经分装好，保存与 -20℃。头天下午或晚上配胶，分离胶和浓缩胶一起配好，带上梳子，放入潮湿的自封袋内放入4°冰箱备用。 8:00
从冰箱里取出蛋白样品，用 PCR 仪 95℃ 加热 5 min。混合均匀并离心。 8:30
取出昨晚配好的胶，组合，加电泳液。在电泳液里拔梳子能稍微容易一些。用 10 μL 的枪加样。 9:00
开始电泳。恒流 30mA 一般 1 个小时足够了。 9:30
开始准备转膜用的滤纸和 PVDF 膜，PVDF 膜泡甲醇。一般 8cm 的宽是固定的，所以如果要裁胶的话可以先大概估计一下。 10:10
电泳结束（假设电泳用了 70 分钟），起开玻璃板，裁出胶上所要的条带，如果整块胶转就更方便了。把胶放在盛有转膜缓冲液的培养皿里。 11:00
转膜开始（这里裁纸和铺三明治还是比较费时间的，我一般要用 30 到 50min，所以这里要抓紧时间）。 12:00
转膜结束（这里按 60min 的半干转的时间来计算）。开始封闭 1h。 13:00
封闭结束，开始孵育一抗（在这里你可以选择一抗孵育过夜，如果不过夜的那一天就能结束），如果不过夜的话我一般选择 37℃1h，然后在室温（23℃ 左右）再 1h。 15:00
一抗孵育结束。TBST 洗涤 3*10min 或者 5*6min。 15:30
开始孵育二抗。室温 1h 足够了。 16:30
二抗孵育结束。TBST 洗涤 3*10min或者5*6min，这里推荐采用 5*6min。 17:00
ECL 发光，压片 10min，显影 1min，定影 10min，那么在 18:00 之前你就能看到结果了，呵呵，如果结果不好还有后招，用 stripping（一抗二抗洗脱液）洗涤，我用的是碧云天的碱性一抗二抗洗脱液，按照说明书来一般 20min 就行，然后洗涤几次，重新封闭 1h，然后一抗过夜。明日在继续战斗。这样的话 18:30 之前也能结束战斗了。
【完】
