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文 |不会飞的呆瓜

编辑 |不会飞的呆瓜

前言

拉曼散射光谱是一种十分重要的检测手段，具有耗样量少、检测速度快、谱图容易识别等特点，采用这种方法可以直接进行无损伤的定性或者定量分析，操作也十分方便。

正是因为这些优点， 拉曼光谱分析经常被用于DNA、蛋白质分析检测以及对细胞、病毒的原位检测分析。

表面增强拉曼光谱是拉曼散射光谱应用中的一种，研究表明表面增强拉曼光谱信号强度要高于普通拉曼光谱数倍，目前已经普遍被应用于生物检测以及免疫传感器的构建。

锐钛矿型介孔二氧化钛因其独特的晶格结构与其多孔洞的形貌特点，与一般材料相比，比表面积比较大，有人曾制备出比表面积达到233.22m2/g，孔容积达0.4cm3/g的介孔二氧化钛。

大的比表面积导致材料本身具有很强的吸附性，能够与其他纳米粒子稳固的结合在一起，此外，锐钛矿型二氧化钛本身良好的光学性能和表面形貌使其在光学检测领域有着广泛的应用。

通过化学还原等方法可以将银单质制备成为粒径在几十个纳米范围内的银纳米粒子，由于纳米银具有表面等离子共振的性质，当纳米银接受到光照后，其表面的电子会在银和介质之间的界面上产生一个增强的电磁场。

利用这个性质可以提高生物分子检测的灵敏度，此外，银纳米粒子还具有表面增强拉曼信号的性质，基于这种性质利用银纳米颗粒作为表面增强拉曼散射（SERS）的基底，实现了对不同价态砷离子浓度的检测。

对巯基苯甲酸分子带有一个苯环，在拉曼光谱中苯环的特征峰具有杂峰少，峰强度高等特点，适合用于定量检测。

利用对巯基苯甲酸构建的免疫传感器用于检测IgG抗原，检出限低至700pM。

本实验中首先将纳米介孔二氧化钛负载于银纳米粒子上，经过对巯基苯甲酸的修饰后，利用纳米银与介孔二氧化钛能够协同增强对巯基苯甲酸中苯环的拉曼散射的原理制备成为拉曼信标分子，拉曼信标分子表面裸露的羧基能够与甲胎蛋白抗体结合。

将磁性微球与甲胎蛋白（AFP）一抗结合起来，再利用抗原抗体特异性免疫反应的原理使拉甲胎蛋白一抗、抗原，甲胎蛋白二抗形成“三明治”式夹心化合物，磁性分离后进行拉曼检测，在此实验中，采用对巯基苯甲酸修饰的介孔TiO2/Ag纳米复合粒子（TiO2/Ag/4-MBA）作为拉曼信标分子制备免疫传感器的方法未见报道。

实验数据和结果

钛酸四丁酯（TBOT，98%，上海润洁化学试剂有限公司），牛血清蛋白（BSA，上海阿拉丁试剂有限公司），N-羟基丁二酰亚胺（NHS）（上海阿拉丁试剂有限公司），1-乙基（-3-二甲基氨基丙基）碳二亚胺盐酸盐（EDC）。

三嵌段共聚物（P123）（北京百灵威科技有限公司），甲胎蛋白（AFP）（北京博奥森生物技术有限公司），甲胎蛋白抗体（北京博奥森生物技术有限公司），甲胎蛋白定量测试试剂盒（郑州博赛生物技术股份有限公司）。

单分散聚乙烯微球（-COOH，1-2µm，天津倍思乐色谱技术开发中心），4-巯基苯甲酸（C7H6O2S，99%，百灵威化学技术有限公司），氯金酸（HAuCl4·4H2O，99.9%百灵威化学技术有限公司），柠檬酸钠（C6H5Na3O7·2H2O，99.0%。

天津市鼎盛鑫化工有限公司），硝酸银（AgNO3，99.8%，上海化学试剂有限公司），硼氢化钠（99.9%，上海阿拉丁试剂有限公司），试验中均采用二次蒸馏水配制试剂。

拉曼光谱仪（英国inViaRamanMicroscope），紫外分光光度计（Cary50，美国瓦里安公司），扫描电子显微镜（JSM-6700F），透射电子显微镜（JEM-2100）。

按照方法制备银纳米粒子，称取1.00g柠檬酸钠，用二次蒸馏水充分溶解并定容到100mL备用。

称取1.00g硝酸银，用二次蒸馏水充分溶解并定容至100mL，置于避光处保存备用。

称取0.01g硼氢化钠，用二次蒸馏水溶解并定容至10mL，置于避光处备用，连接好冷凝回流装置。

向250ml三口烧瓶中加入70mL二次蒸馏水同时进行搅拌，加入20mL柠檬酸钠溶液（1%），继续搅拌并加热至70℃，保持20min，取1.7mL硝酸银溶液（1%）滴加至三口烧瓶中，反应10min后，移取2mL硼氢化钠溶液（0.1%）滴加至三口烧瓶中，70℃下恒温水浴1h，自然冷却至室温，作为银种子置于避光处保存。

使用另外一种方法制备银纳米粒子，连接好冷凝回流装置，向250mL三口烧瓶中加入75mL二次蒸馏水同时加热搅拌至沸腾，加入5mL柠檬酸钠溶液（1%）搅拌15min。

取10mL由步骤2.2.2.1制备好的银种子加入到三口烧瓶中，搅拌2min，取1.7mL硝酸银溶液（1%）滴加到反应体系中，搅拌回流1h，向体系中加入2mL柠檬酸钠溶液（1%），搅拌2min，取1.7mL硝酸银溶液（1%）加入到体系中，回流1h。

重复上述步骤，最后冷至室温，作为28nm粒径的银米粒子避光保存备用。

取2mL柠檬酸钠溶液（1%）加入到80mL二次蒸馏水中，在80℃下加热搅拌15min，向体系中加入10mL28nm粒径的银纳米粒子，继续搅拌10min，取1.7mL硝酸银溶液（1%）滴加到体系中，继续搅拌1h，自然冷却至室温，作为45nm粒径的银纳米粒子避光保存备用。

称取5.0mL的钛酸四丁酯（TBOT），滴加到20mL无水乙醇中，30℃下搅拌1h得到（1）溶液，另取40mL乙醇并加入一定量的盐酸，置于40℃下搅拌30min得到（2）溶液。

缓慢的将（1）溶液和（2）溶液混合并置于室温下搅拌3h得到（3）溶液，称取一定量的三嵌段共聚物（P123）溶解到10mL乙醇中，充分搅拌30min得到（4）溶液，最后将（3）溶液分散到（4）溶液中加热搅拌1h得到透明二氧化钛溶胶。

取一干净培养皿，用于盛放二氧化钛溶胶，将胶体置于40℃条件下挥发溶剂，之后在60℃条件下陈化24h，最后置于箱式电阻炉中灼烧2h得到纳米介孔二氧化钛。

称取0.100g介孔二氧化钛，加入到20mL乙醇中，保持180℃搅拌分散30min，加入20ml制备的银纳米颗粒，继续搅拌1h，离心后重新分散在20mL乙醇中，重复三次，取沉淀物干燥备用。

称取0.050g沉淀物分散在10mL乙醇中，加入0.1g4-巯基苯甲酸（4-MBA），于150℃下搅拌3h，离心取沉淀物，用无水乙醇洗涤沉淀物三次，干燥后备用。

称取0.05g对巯基苯甲酸分散到10mL无水乙醇中，加热搅拌5min，向体系中加入10mL28.5nm粒径的银纳米颗粒，继续搅拌0.5h，离心取沉淀物，并经三次洗涤后得到纳米银粒子标记的对巯基苯甲酸颗粒。

取相同量的4-MBA、Ag/4-MBA和TiO2/Ag/4-MBA进行拉曼散射检测。

称取0.001g步骤2.2.4中制备好的拉曼信标分子材料，加入100μLN-羟基丁二酰亚胺（NHS，0.2M）和100μL1-乙基-（3-二甲基氨基丙基）碳二亚胺盐酸盐（EDC，0.8M）置于恒温振荡器中37℃下震荡1h。

离心，保留沉淀物，向沉淀物中加入100μL甲胎蛋白（AFP）二抗（20μg/mL），置于恒温震荡器中，在37℃下震荡24h，用PBS缓冲溶液洗涤三次，离心除去上清液，得到拉曼信标分子标记的AFP二抗。

量取50μL羧基修饰的单分散聚乙烯微球（1-2µm），并用咪唑-盐酸（0.1M，pH=7.4）洗涤数次，磁性分离后向其中加入100μLN-羟基丁二酰亚胺（NHS，0.2M）和100μL1-乙基-（3-二甲基氨基丙基）碳二亚胺盐酸盐（EDC，0.8M）置于恒温振荡器中37℃下震荡1h，磁性分离。

加入400μLPBS缓冲溶液（pH=7.4）定容，加入100μL甲胎蛋白（AFP）一抗（20μg/mL），置于恒温震荡器中，在37℃下震荡24h，磁性分离，用PBS缓冲溶液洗涤三次，磁性分离后定容至400μL。

向2.2.7制备的抗体包被的磁性微球中加入100μL1%的牛血清蛋白（BSA）溶液，放置在恒温震荡器中震荡1h用以封板。

用PBS缓冲溶液（pH=7.4）洗涤三次，磁性分离并定容至400μL，加入100μL不同浓度的AFP抗原摇匀后置于恒温震荡器下，震荡12h，用PBS缓冲溶液（pH=7.4）洗涤三次，磁性分离并分散到500μLPBS缓冲溶液中备用。

将上述500μL免疫磁性微球加入到2.2.5制备的标记了拉曼信标分子的AFP二抗中混匀，置于震荡器中震荡12h，离心后用PBS缓冲溶液洗涤三次，重新分散到100μLPBS缓冲溶液，用于拉曼散射检测。

分别取0.01g介孔二氧化钛，分散到乙醇中，加热搅拌20min以使介孔二氧化钛能够更好的分散，另外各取0.1mL、0.5mL、1mL、2mL、4mL、6mL的银纳米颗粒加入到体系中保持180℃搅拌回流1h。

离心干燥备用，称取0.01g对巯基苯甲酸，用无水乙醇定容到100mL， 将上述材料分别分散到对巯基苯甲酸中进行拉曼散射光谱检测。

称取0.1g介孔二氧化钛，分散到20mL无水乙醇中，加热搅拌30min以使介孔二氧化钛充分分散，向体系中加入20mL28.5nm粒径的银纳米粒子，保持回流搅拌1h后离心干燥。

分别称取0.01g上述材料分散到无水乙醇中，加入0.001g、0.005g、0.01g、0.02g、0.04g、0.06g对巯基苯甲酸，加热搅拌1h后，离心干燥并用于拉曼散射光谱检测。

取纯度为99.99%的Pt片，依次放入到无水乙醇溶液、*酮丙**溶液中超声15min，放置在恒温干燥箱中干燥备用。

取2.2.8中制备的检测溶液0.8μL滴到处理好的Pt基底上，自然晾干后进行拉曼散射检测。

结论

本实验采用对巯基苯甲酸修饰的负载介孔二氧化钛的银纳米粒子作为拉曼信标分子，如上图所示，对巯基苯甲酸S原子能与Ti原子形成Ti-S键，此外，S原子也可以与Ag原子结合形成Ag-S键。

通过Ti-S键和Ag-S键可以将对巯基苯甲酸修饰在复合材料（Ag/TiO2）表面，裸露出来的羧基经过EDC和NHS的活化后，能够与甲胎蛋白（AFP）二抗中的氨基结合起来。

带有羧基修饰的磁性微球同样也可以在EDC和NHS的作用下与甲胎蛋白（AFP）一抗中的氨基结合起来。

固载在磁性微球上的一抗、拉曼信标分子标记的二抗与甲胎蛋白（AFP）抗原形成双抗夹心式的结构，甲胎蛋白（AFP）抗原的含量和与二抗相结合的拉曼信标分子的含量有一定的比例关系。

当抗原含量越多时，会有更多的拉曼信标分子通过二抗与抗原结合，所测得的拉曼信号值也就越高，从而实现对AFP抗原的定量检测。