尔云间 一个专门做科研的团队

欢迎点赞+收藏+关注，免费领取原文文献[给你小心心]

2024悄然而至，很多科研er的毕业季也是越来越近了哦，如果大家对自己的文章还有所期待，今天这篇大有潜力的文献可一定不能错过呀~~

相较于普通细胞，肿瘤细胞中的信号通路可是科研创新点的“黑土地”。小云今天奉上的这篇文献，着眼于头颈癌的患者生存和淋巴结转移两项特征，重点研究了淋巴结转移这一临床特征受p53-DREAM通路调控的原理。各位稍安勿躁，小云这就上菜啦：

1.结合头颈癌的特点，针对性地就患者生存和淋巴结转移LNM两个部分的相关基因进行深入研究。

2.通过常规的GSEA、无监督聚类和GSOA（基因集过表达分析），患者生存相关基因包括代表性的肿瘤生物学过程基因。而LNM相关基因几乎普遍与恶性肿瘤细胞中的上皮去分化相关。

3.将LNM正相关的细胞周期基因的表达与特定的p53-DREAM通路关联起来，并在TP53突变和HPV+ve的恶性肿瘤细胞中验证结论（ps：p53-DREAM信号通路相关研究尚且不多，可是极有潜力的热点哦）。

方法好，创新点和选题更要“有嚼头”，事半功倍发表一区期刊！想复现文章的分析结果，为自己的小论文打基础的快来试试吧！ 告诉想要了解单细胞分析的流程步骤，或是对肿瘤发文方向感到迷茫的老铁们，小云指点迷津可是有一套哦[得意]！

题目：p53- DREAM介导的细胞周期基因抑制缺失是头颈癌淋巴结转移的驱动因素

杂志：Genome Medicine

影响因子：IF=12.3

发表时间：2023年11月

回复123领取原文，文献编号:240118

研究背景

头颈癌(HNCs)起源于口腔、喉部、口咽部和下咽粘膜衬里的鳞状上皮细胞。患者之间的生存和治疗反应差异很大，这可能反映了HNC的内在异质性。LNMs是一个独立的预后因素，与远处器官转移的风险增加有关。大多数患者要么对包括手术、放疗和化疗在内的标准HNC治疗无反应，或产生耐药性；只有一小部分患者对免疫检查点免疫疗法有反应。所以更好地了解影响HNC预后的生物学因素可以促进临床生物标志物的发展，并可能导致新的靶向治疗。

发生在口咽部的HNCs的一个子集是由人乳头瘤病毒(HPV)引起的。HPV阳性(HPV+ve)口咽癌(OPC)具有良好的生存和治疗反应。HPV+ve HNC在生物学和临床上都与HPV- ve HNC不同，后者主要由吸烟和/或饮酒引起，约80%的病例与TP53突变有关。在HPV−ve HNC中，TP53突变与较差的生存率以及淋巴结和远处转移的发生率增加有关。

数据来源

研究思路

方法：对29项基因表达研究进行meta分析，其中包括2074例原发性HNC活检，以确定与生存和淋巴结转移(LNM)相关的基因和转录途径。为了了解这些基因在HNC中的生物学作用，作者通过整合来自分选细胞群的单细胞RNA-seq和bulk RNA-seq，确定了它们相关的癌症途径，以及在HNC肿瘤微环境中表达它们的细胞类型。

主要结果

1. 管理用于HNC基因表达meta分析的资源

作者收集了29个主要的HNC基因表达数据集及临床数据，专门用于识别与两个结果变量相关的基因：患者生存和淋巴结转移(LNM)状态，包括2074例HNC肿瘤，共有1638例患者(跨越16个队列)有生存结局数据，1449例患者(20个队列)有LNM状态。

2. HNC生存相关基因反映TME组成、EMT和缺氧

作者首先在16项研究中确定了与HNC生存相关的基因。利用Cox回归模型计算每个数据集中每个基因与生存相关的z分数，然后用Liptak加权meta-z将z分数汇总为每个基因的meta-z分数。479个基因与生存呈正相关，730与生存负相关(图1A)。Cox回归z分数在包含HPV+ve OPC和不包含HPV+ve OPC之间总体上是一致的(图1A)，并且在排除HPV+ve OPC的meta分析中仍然与生存率显著相关，表明HPV不会驱动这些基因与生存率的关联。

作者应用基因集富集分析(GSEA)来鉴定生存相关基因中富集的途径和功能(图1A)。促存活基因在免疫途径中富集，特别是抗原受体介导的信号传导相关基因(CD247、IL2RG)和免疫激活相关基因(CD2)。抗存活基因为上皮-间质转化(EMT)基因(SNAI2、FN1)和缺氧基因(GAPDH、ENO1)，以及由多梳抑制复合物1 (PRC1)组分酶BMI和PCGF2调控的基因(VEGFC、CXCL1)。这些富集与白细胞浸润和EMT在预防和促进HNC进展中的已知作用是一致的。

接下来描述由这些基因所代表的各种预后途径和过程。应用无监督聚类方法Phenograph，将通过meta分析确定的生存相关基因聚类，鉴定出6个基因簇：3个(S3, S5-S6)主要由促生存基因组成，3个(S1-S2, S4)主要由抗生存基因组成(表1)。

大多数这些基因具有相似的泛癌症生存相关性，表明其对癌症预后有影响。在调整HPV状态后的线性模型中，所有与生存相关的特征仍然与生存显著相关。基因集过代表性分析(GSOA)用于识别与每个存活基因簇最显著重叠的MSigDB基因集。抗生存簇中，S1在EMT标记物、PRC1负调控基因、或参与缺氧的基因中也被过度代表；S2包括参与核糖体和核糖核蛋白生物发生、MTORC1信号传导和蛋白质错误折叠反应的基因；S4代表了EMT标记、TGF β信号上调的基因和编码细胞外基质成分的基因。促生存簇S5和S6分别与T细胞活化和鳞状上皮分化相关的基因过多，但没有基因集与促生存基因簇S3显著重叠。

表1预后基因簇综述

3. 上皮分化是HNC淋巴结转移的关键因素

接下来作者确定了在LNM阳性(LNM+)患者原发肿瘤中相对于LNM阴性患者肿瘤差异表达的基因。应用随机效应模型发现共1449个原发HNCs，共420个基因在LNM+患者的原发肿瘤中表达更高(pro-LNM基因)和457个低表达基因(anti-LNM基因)(图1B)。基因特征与LNM状态的关联与HPV状态、年龄和性别无关(图1B)。

有丝分裂和细胞周期基因富集了pro-LNM基因，特别是受E2F转录因子调控的、参与G2/M检查点的基因(CDK1、CHEK2)(图1B)，包括增殖标记物MKI67以及参与DNA复制、重组和修复的基因（RAD51、MSH6）。anti-LNM基因在鳞状上皮终末分化过程中富集，包括IVL、多种角蛋白(KRT2、KRT10)和钾化因子相关肽酶(KLK6-14)，表明LNM与原发肿瘤中去分化或上皮特性的丧*密失**切相关。anti-LNM和pro-LNM特征分别与肿瘤分级(即恶性细胞内病理分化水平)呈强正相关和负相关(图2A)。LNM相关基因的表达显示出从组织学上正常的肿瘤邻近组织到肿瘤的逐步进展，并且去分化程度越来越高(图2B)。420个pro-LNM基因中的324个(77%)和457个anti-LNM基因中的374个(82%)也与分级相关，这些关联的基因meta-z高度相关(图2C)。

在1642个主要HNCs(20项研究)的联合数据集中，利用表型图聚类再次确定了6个LNM相关基因簇，L1-L3主要由anti-LNM基因组成，L4-L6主要由pro-LNM基因组成，所有6个簇与肿瘤分级密切相关(图2A)。L1和L2在上皮分化基因中被过度代表。L2簇与生存簇S6有30个基因重叠，鉴定出一组与生存呈正相关、与转移负相关的分化相关基因。L3富集细胞内蛋白转运和RNA剪接。在致癌KRAS和IL2-STAT5信号通路成员中，以及调节多种免疫过程的基因中，L5基因被过度代表。最小的簇L6在RNA剪接中被过度代表，进一步表明剪接调节在转移中的作用。

图1 基于meta分析的预后基因鉴定:与A存活和B淋巴结转移(LNM)相关的基因

图2 淋巴结转移(LNM)特征与上皮去分化和不典型增生的关联

4. P53 - DREAM通路的破坏是HNC的一个促LNM因素

pro-LNM的L4是最大的Pro LM基因簇，许多基因代表周期性表达(振荡)的G2/M和G1/S期基因(图3A, B)，表明细胞周期的不同阶段具有特异性作用。被E2F4/5抑制的细胞周期基因子集通过p53-p21- DREAM - CDE/CHR通路(“p53- DREAM”通路)间接受到p53的调控。

由于p53失活发生在大多数HNCs中并与LNM相关，作者研究了LNM特征与一组201个p53- DREAM抑制基因的重叠(图3A)。p53-DREAM靶标在pro-LNM簇L4中被显著地过度代表(图3A)。通过分析L4基因与TP53突变和HPV状态的表达关系，验证了L4基因簇在HNCs中由于p53失活而过表达的假设(图3C)，因为p53是HPV E6癌蛋白泛素化介导降解的靶标。L4基因簇在HPV+ve肿瘤和TP53mut/ HPV - ve HNCs中都上调，表明这些基因可能在HNC中由于p53-DREAM抑制的丧失而上调。此外L4簇基因在TP53突变不同功能类别的HNCs中表达上调(图3C)。

p53可转录激活CDKN1A(编码p21)，而CDKN1A的周期蛋白依赖性激酶抑制活性促进DREAM复合物的组装。在meta分析中CDKN1A与LNM呈负相关。在p53直接激活的基因中，除了CDKN1A外，LNM相关基因没有显著富集，尽管促生存基因与p53激活的基因显著重叠(图3A)。总之p53失活通过上调p53-DREAM抑制的基因来支持LNM，而p53活化基因的下调通过LNM独立机制影响生存。

L4簇基因在HPV+ve HNCs中的表达水平特别高(图3C)，这可以解释为HPV E6和E7癌蛋白使p53和DREAM失活，以及HPV E7介导的肿瘤抑制因子Rb1的抑制。这些前LNM基因的上调可以解释HPV+ve HNCs尽管预后良好，但LNM的发生率特别高。

图3 与p53-DREAM通路介导的抑制相关的前lnm簇L4基因的解除管制

5. HNC TME中的特定细胞类型表达生存相关基因

鉴定表达预后基因的细胞类型可以深入了解它们在疾病进展中的作用。作者通过两组HNC scRNA-seq数据集来鉴定表达生存相关基因的细胞类型(表2)。通过分析从原代HNCs中分类的四个细胞群体的一组bulk RNA-seq数据中存活和LNM基因的表达，进一步验证(表2)。其中包括恶性细胞(n=13)、成纤维细胞(n=10)、淋巴细胞(n=15)和内皮细胞(n=12)。应用CIBERSORTx推断bulk RNA-Seq数据集中细胞类型的分数。

在所有三组数据集中，抗生存簇S1和S2基因在恶性和间质源性间质细胞中均有表达(表2)。簇S1基因的表达与“EMT评分”(一种基于上皮和间质基因表达的常用EMT指标)。在恶性细胞中，S1簇基因的表达在一个不同的细胞亚群中强烈升高，显示出高EMT评分。S4簇基因在很大程度上仅限于成纤维细胞，包括已知的成纤维细胞标志物（FAP、FN1），主要在称为癌症相关成纤维细胞1（CAF1）的亚群中表达。促生存簇S3基因在细胞类型中普遍表达，而S5基因仅限于细胞毒性T细胞和其他淋巴细胞。促生存簇S6仅限于非增殖(G1期)恶性细胞的一小部分亚群，这些细胞分化特别好。

表2 在scRNA-Seq和流式细胞数据集中，每种预后特征中在每种细胞类型中表达最高的基因百分比

6. LNM基因与P53 - DREAM介导的抑制缺失相关的恶性细胞去分化和增殖有关

scRNA-Seq数据中的LNM基因特征分析证实，LNM+原代HNCs (N=6)组合细胞中anti-LNM基因下调，pro-LNM基因上调，并根据细胞类型、细胞周期和TP53突变状态进行调整(图4A)。LNM相关基因主要在恶性细胞中表达(图2D和4A)，而存活相关基因在不同细胞类型中表达异质性。anti-LNM基因的两个主要簇(L1和L2)都局限于分化良好的恶性细胞簇，这些细胞簇也表达促生存簇S6基因(表2，图2D)。anti-LNM簇L3基因在各种细胞类型中普遍存在。

簇L4是最大pro-LNM基因簇，主要在恶性细胞中表达(表2)，特别是在G2/M细胞周期阶段(图2D和3D)。它们在TP53突变型(TP53mut) HPV-ve HNCs (N=5)的恶性细胞中表达上调(图3D)，意味着它们的过表达是由p53失活引起的。簇L4与TP53mut和TP53wt HNCs恶性细胞中的CDKN1A表达呈负相关(图3E)，表明在没有TP53突变或HPV的情况下，通过TP53缺失等其他机制下调p21的表达可能会破坏DREAM介导的proLNM基因抑制。许多簇L5基因主要在白细胞中表达。簇L6基因在不同细胞类型中普遍表达。综上，LNM相关基因在恶性细胞中主要是失调的。这与LNM相关基因在上皮分化和细胞周期调节中的功能作用，及其与肿瘤分级相关的观察结果是一致的。

图4 淋巴结转移(LNM)阳性原发性HNCs和淋巴结转移中LNM基因特征的解除

7. 低分化LNM相关的恶性细胞表达非EMT相关的干性基因

在两个scRNA-Seq数据集中，簇L4在恶性细胞的子集也高度表达“干性特征”，包括HNC和胚胎干细胞(ESC)特异性基因中与肿瘤分级正相关的基因(图2D)。通过CytoTRACE分析评估，这种恶性细胞亚群表现出高度的转录多样性（多能细胞的标志）。在恶性细胞中，L4基因簇与去分化和干性特征呈线性相关(图2D)。综上，表达LNM簇L4基因的恶性细胞亚群可能是具有转移种子潜力的癌症干细胞样细胞。

在scRNA-Seq中，pro-LNM簇L4基因和anti-LNM基因表现出“互斥”的表达模式，表明它们之间存在拮抗关系。因此恶性细胞中上皮分化转录程序的缺失可能代表了p53- DREAM介导的抑制缺失的继发性后果，即向增殖状态的致癌转换。作者认为pro-LNM基因不包括EMT或间质相关基因，并且与EMT评分无关。

8. 淋巴结转移后LNM相关基因的解除调控增强

接下来作者研究LNMs在转移后是否会进一步失调。首先比较了原发HNCs (N=29)和患者匹配LNMs (N=72)的 bulk RNA-Seq谱中pro-LNM基因和anti-LNM基因的平均表达，揭示了LNMs中相对于原发肿瘤的anti-LNM基因的显著下调，以及pro-LNM基因一定程度的上调(图4B)。接下来比较了LNM相关基因在原发性HNCs和患者匹配的LNMs的恶性细胞中的表达，证实了两个scRNA-seq数据集中LNMs恶性细胞中anti-LNM基因下调，调整了已知的LNM基因表达修饰因子，包括细胞周期和TP53突变状态(图4B)。

9. LNM相关基因的解除调控是早期致瘤事件

作者观察到在p53失活的恶性细胞中，pro-LNM基因上调，由此假设假设p53- DREAM靶基因的转录抑制可能在早期肿瘤发生过程中丢失。作者分析了86例口腔癌前病变(opl)中LNM相关基因的表达，发现随着癌前疾病进展的进展和上皮异常增生的增加，pro-LNM簇L4基因被强烈上调，上皮异常增生是一种用于对opl进行分级的组织学表型，可识别出具有较高恶性转化风险的opl(图2E)。而anti-LNM与进展呈负相关(图2E)。综上，这些发现表明L4 p53-DREAM靶基因的上调伴随着上皮去分化，在恶性转化之前，可能是LNM的早期驱动因素。

图5 HNC中LNM的主要原因模型提出:在正常的鳞状上皮细胞中，p53通过p53- dream通路间接抑制细胞周期基因，从而诱导细胞周期阻滞

文章小结

肿瘤什么方向还值得做?这篇文章真是打了个好样，作者目的明确地选择头颈癌中关于淋巴结转移方向，进一步通过差异表达基因群的特征，深挖与尚有研究潜力的p53-DREAM通路的关联，论证在恶性头颈癌肿瘤细胞中，p53-DREAM通路被破坏对淋巴结转移事件的影响。难是真不难，但对我们选题的思路还是很有启发性的， 不知能不能帮各位小伙伴拿下下一篇SCI啊~也想用信号通路的分析验证提升肿瘤研究文章的档次？还是对自己的数据和分析方法感到迷茫？不要慌张，小云一定帮你有的放矢！

往期推荐

• 南昌大学一附院谢勇团队：堪比董宇辉的7分+单基因生信！铁死亡+多组学+机器学习+单细胞，buff多到放不下
• NHANES数据库怎么发高分？上海交大医学院汪一心团队11分+横断面研究，6种分析方法聚焦环境污染，0实验稳稳拿下！
• 哈尔滨医科大学李颖团队：孟德尔随机化如何4图拿下中科院一区？ 代谢角度切入新颖选题+统计创新方法，就是这么给力！
• 想在“细胞衰老”领域玩出花吗？四川大学华西医院团队这篇39+封面文章一定不要错过！让你2024国自然中标率翻倍！