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编辑|冷紫葉
机体的能量代谢稳态是由能量摄入和能量消耗所保持平衡的。能量摄入(比如摄食摄入)和能量消耗(总能量消耗)达到平衡时，机体处于能量代谢稳态。能量失衡时，如能量摄入过多，会导致生长速度减缓、瘦体重减轻、脂肪堆积，从而增加肥胖及其他代谢性疾病发生的风险。机体的任何生理活动的完成都必须通过三大产能营养素(糖、脂肪、蛋白质)的物质代谢提供能量，除运动时所完成的机械功以外，大部分能量都迅速转换为热能，主要用于维持机体的体温。多余的能量则以高能磷酸键的形式储存在脂肪组织中。当机体需要能量时在神经体液的作用下和各种酶的参与下甘油三脂裂解成游离脂肪酸释放能量。
20世纪初，维生素D由于可以用来预防和治愈询楼病而首先被发现。随后学者们不断研究发现，人体不能自行合成维生素D，需要通过日晒或从食物中摄入获得。人体皮肤经紫外线照射后，其内的7一脱氢胆固醇转变为不具活性的维生素D前体，再在肝脏中P4s0酶的作用下，经2s-经基化生成，通常作为维生素D生物标记物的2s- ( OH ) D ; 2s- ( OH ) D转运至肾皮质后被位于肾脏近曲小管上皮细胞线粒体内的2s(OH) D:经过la经化酶经化为具有更高活性的1,2s}oH}2D301,2s}oH}2D:随后通过与靶组织内的维生素D受体(vitaminD receptor, VDR)结合，发挥生物学作用。
动物基因型鉴定
主要仪器
实验步骤
(1)溶解组织:新生小鼠即鉴定基因型。剪新生小鼠尾巴(长约0.5 cm)置于1.5ml EP管中，加入500贝鼠尾裂解液和蛋白酶K 50贝，55 0C水浴过夜，直至鼠尾完全溶解。次日将样本置于室温。
(2 ) 12000 rpm离心10 min，将上清液倒入新的1.5 ml EP管中，加入1 ml无水乙醇(约2倍上清体积)，盖紧盖子后轻摇，可见絮状沉淀。13000 rpm离心15 min之后，弃掉上清液。再次加入管内70%乙醇1 ml，进行洗涤，13000 rpm再次离心15 min,弃上清，收集沉淀，室温静置15 min。
(3)每个EP管中加入30-50贝灭菌水，在3 7 0C恒温箱中充分溶解1h。待DNA全部溶解之后可放于一20 0C冰箱中保存，或直接进行PCR实验。
(4)PCR反应体系Reagent nameDNA template2 X taq10 }1 forward primer10 }l reverse primerddH20Volume。
(5 ) PCR反应条件
PCR反应产物电泳
配制2%琼脂糖凝胶:称取0.5 g琼脂糖，加入50 ml的TAE缓冲液中，混匀，放入微波炉中加热3^'4 min，直至琼脂糖完全融解，取出置通风橱中，冷却至650C,加入2贝EB液，混匀，倒入预先准备好的电泳槽中，立即插入梳子。待其完全冷却时，拔出梳子，调整好凝胶方向并将凝胶置于TAE电泳缓冲液中。向PCR产物中加入6X上样缓冲液5贝，混匀、离心后，取12贝加入已经预制好的2%琼脂糖凝胶的上样孔中，120 V电泳10 min。将电泳后的凝胶拍照、存档、记录基因型(结果如下图所示)。
1.2.3.4. 5为基因敲除纯合子小鼠;6为基因杂合子小鼠;8为野生型小鼠
试剂配制
- 蛋白裂解液试剂配方:
- TBST洗涤液配方(1L):
- 电泳缓冲液配方(1L):
- 转印缓冲液配方(1L):
- 10%分离胶配方:
- 5%浓缩胶配方:
蛋白浓度的测定
取96孔板，用BCA法于全自动酶标仪上测定组织蛋白浓度。，取50贝完全融化的标准品稀释至250 }l，使其终浓度达到1 mg/ml，将标准品按照0, 2, 4, 6, 8, 12, 16, 20 }l依次加入到96孔板中，用PBS溶液补足至20贝，重复三个复孔。将样品稀释20倍，加20贝到%孔板中，重复三个复孔。每孔中加200 }l 1 X 6520染色液，室温静置5 min。用酶标仪测定A595或者A560}-610之间的波长的吸光度，绘制出标准曲线，根据所得的标准曲线计算每个样品的蛋白浓度及上样量。
免疫印迹反应
(1)灌制分离胶和浓缩胶胶:取长短不一的两块玻板，用脱脂棉(甲醇或乙醇)擦拭，挥发至干。清洁玻璃板后，对齐长板和短板插入塑料制胶器中，夹紧固定于配胶架上，加水检测是否有漏点。将玻板封闭好以确保不漏胶，随后倒掉两板中的水。根据所检测的目的蛋白分子量配制适当浓度的分离胶，将凝胶溶液平稳地注入两层玻板中，缓慢持续注入至适当高度后停止，然后注入一层水隔绝空气，静置至凝胶形成。待分离胶完全凝固后，约30 min后胶面与上面的水相会出现明显的界面，倒掉胶面上的水层后灌注浓缩胶，以连续平稳的流速在分离胶上面注入浓缩胶液至两玻板间，然后立即插入梳子，室温静置30 min后查看是否凝固。
(2)加样跑胶:将梳子垂直向上轻轻拔出，加入电泳缓冲液冲洗泳道以排出气泡，根据浓度计算上样体积，按顺序加入待测样品，最后加入蛋白marker，加样速度宜轻柔。
(3)转膜:在电泳结束30 min前，剪取与分离胶大小相同的滤纸和PVDF膜，将PVDF膜先用甲醇浸泡3^'S min用以激活，再将滤纸和PVDF膜一同浸泡到转印缓冲液中，按阴极一海绵一滤纸一凝胶一PVDF膜一滤纸一海绵一阳极的顺序安装到转膜槽中，注意PVDF膜与凝胶之间应无气泡。将转膜用夹板放入转膜槽中，凝胶面向负极(黑色)，膜面向正极(红色)转膜槽中放入冰盒，并倒满转印缓冲液，将整个转膜槽放入到大的冰盒中，防止过热，连接电源，60 V电压转膜约100 min 。
(4)封闭及一抗孵育:转膜结束后，用ddH20轻轻漂洗PVDF膜，去除转印缓冲液。PVDF膜可以用丽春红进行染色，以判断转膜是否成功。随后在封闭盒中加入5%脱脂奶粉的封闭液进行封闭，室温摇晃1h，之后用1 X TBST稍加漂洗。一抗孵育4 0C过夜或者室温4 h。根据不同抗体说明书的不同，加入浓度在1: 2000-1:500的抗体。
(5)二抗孵育及发光鉴定:一抗孵育结束后回收一抗，室温，用1 X TBST漂洗PVDF膜3次，每次10 min。根据一抗属性选择二抗室温孵育2h，根据说明书的要求浓度为1: 20000孵育完毕的膜置于摇床上清洗3次，每次10 min，按1:1比例避光配置好发光液，均匀滴加在PVDF膜上，通过凝胶成像系统进行发光，保存图像，分析实验结果。
Rea I -T i me PCR反应
根据Real Time PCR试剂盒说明配制总体系为:10 }1 ( 2 X SYBR, 5 }1; 10 }MForward primer, 0.4 }l; 10 }M Reverse primer, 0.4 }l; Rox Reference Dye, 0.2 }l;RNase free dH20, 3 }1; Template cDNA, 1 }1)，在配制相应体系时确保一切在冰上操作，计算复孔量，依次加入到%孔板中，并用封板膜将%孔板封死(切忌做任何标记)。然后离心，放入7500 Fast Real-Time PCR仪中，按事先设置好的反应程序即:95 0C 5 min, C 95 0C，30秒;5 8 0C，30秒;72 0C，30秒)进行30个反应循环，然后检测结果。其中引物序列为:
小鼠在体生物电信号采集
(1)小鼠血压心率的测量:在小鼠颈部剪开一小口，逐层分离将其气管剥离出来，在气管下方引入一根丝线，气管环状软骨剪开0.2 mm小口，将22G静脉留置针套管插入气管内，用丝线进行固定，另一端接入小动物人工呼吸机进气孔，其中设置呼吸频率为100，呼吸比为1:2，潮气量1 ml 。稳定小鼠呼吸后，分离其颈动脉，注意必须将肺颈脉旁迷走神经和交感神经分离出，以免结扎颈动脉时影响其血压。
颈动脉下方引入两根丝线，将远心端根部结扎，近心端用动脉夹夹闭，随后在远心端剪一小口，将24G静脉留置针插入颈动脉中，随后用丝线结扎，留置针抽出，套管插入充满肝素钠溶液的压力转换器下连的导管中。压力转换器导联线连接在生物信号采集系统的2号通道上，同时软件界面上的2号通道设置为血压，放大倍数为10000，上限为1000，时间常数为0.02 s;压力转换器的高度需与小鼠心脏高度保持一致，点击开始，测量血压，稳定测量15 minx。
(2)小鼠颈交感神经兴奋性的测量小鼠在血压稳定的情况下，剥离颈部神经，其中粗的那根为迷走神经，较细的那根为交感神经，用玻璃分针小心地将其颈部交感神经分离并置于神经保护电极下，导联线接入第三通道并保持导联线垂直，软件中设置通道三为神经放电，放大倍数为5000，上限为3000，时间常数为2 ms，高通虑波为200 Hz。点击开始，收集神经放电信号。
1,25(OH)ZD:是一种脂溶性类固醇衍生物，与体内的很多生物学过程紧密相关。除了对钙稳态和骨代谢起重要调节作用，1,25(OH)ZD:还参与其他很多器官功能和代谢以及疾病过程，包括心血管、肾脏、免疫系统、肿瘤预防和炎症控制等.此外，维生素D还可能与一系列代谢性疾病的发病有关，包括:肥胖和2型糖尿病。有研究报道VDR基因敲除小鼠表型消瘦，腹部脂肪组织较少。 VDR敲除鼠能量代谢率增加，在线粒体呼吸链中参与氧分子传递的解偶连蛋白(uncouplingproteins UCP)家族的蛋白表达量增加，脂肪酸的p氧化能力增加[35]。相反，在VDR转基因小鼠中，VDR在脂肪组织中过表达，机体能量消耗降低，从而引起肥
胖的表型。
然而，体外研究却得出相反的结论。体外研究显示，1,25(OH)ZD:能够在脂肪细胞中抑制关键的脂质形成的转录因子减少脂肪的形成降低脂肪堆积]既往研究多只关注1,25(OH)ZD3/VDR对脂肪组织本身的作用，而没有关注到中枢神经系统，尤其是下丘脑，在保持机体能量稳态和整合来自营养素和体内激素的信号方面扮演着重要作用。本研究通过野生鼠、CYP27B1-/一和胆维丁乳饲养鼠三组动物模型揭示维生素D/VDR在小鼠下丘脑中对能量代谢稳态的作用。
首先我们的研究结果发现，CYP27B1-/一鼠表现为消瘦的表型，体重较小，体内脂肪含量较低，但摄食量和饮水量均较高，同时对高脂饮食有抵抗作用，体重增长不明显。另外，CYP27B 1-/一鼠有较低的血糖水平，较低的血清钙离子、甘油三醋、胆固醇、游离脂肪酸水平和较高的呼吸代谢率。这与VDR-/一表型极为相似CYP27B 1基因编码1-a(OH}asc基因，能够经过经化作用使非活性的25(OH)D:转化为活性的1,25(OH)ZD3o CYP27B1-/一鼠也是用于维生素D研究的常用动物模型。
相反胆维丁乳饲养鼠则表现为肥胖的表型，体型较大，体内脂肪含量较高，但摄食量和饮水量均较低，同时血糖水平较高，有较高的血清钙离子、甘油三醋、胆固醇、游离脂肪酸水平和较低的呼吸代谢率。这与VDR转基因鼠的表型较为一致。
最重要的是，我们发现CYP27B1-/一鼠血清Ang II水平较高，而胆维丁乳饲养鼠血清Ang II水平则较低，相反CYP27B1-/一鼠下丘脑室旁核肾素表达水平较高，而胆维丁乳饲养鼠下丘脑室旁核肾素表达水平较低，提示维生素D/VDR在中枢神经系统中与RAS系统水平呈负相关。
参考文献
[1] Carmona MC, Hondares E, de la Concepcion ML R, et al. Defective thermoregulation,impairedlipid metabolism, but preserved adrenergic induction of geneexpression in brown fat of mice lackingC/EBPbeta. Biochem J, 2005,389(Pt 1):47-56.
[2] Tomasi TE, Ashcraft J, Britzke E. Effects of fungicides on thyroid function, metabolism, andthermoregulation in cotton rats. Environ Toxicol Chem, 2001,20(8):1709-1715.
[3] Chaui-Berlinck JG, Monteiro LH, Navas CA, et al. Temperature effects on energymetabolism: adynamic system analysis. Proc Biol Sci, 2002,269(1486):15一19.
[4] Perseghin G, Lattuada G, De Cobelli E et al. Increased mediastinal fat and impaired leftventricular energy metabolism in young men with newly found fatty liver.Hepatology,2008,47(1):51-58.
[5] Mellanby E. Nutrition Classics. The Lancet 1:407-12, 1919. An experimental investigationofrickets. Edward Mellanby. Nutr Rev, 1976,34(11):338-340.
[6] Masuda S, Byford从Arabian A, et al. Altered pharmacokinetics of 1alpha,25-dihydroxyvitaminD3 and 25-hydroxyvitamin D3 in the blood and tissues of the25-hydroxyvitamin D-24-hydroxylase(Cyp24a1) null mouse. Endocrinology, 2005,146(2):825-834.
[7] Xu丫Hashizume T, Shuhart MC, et al. Intestinal and hepatic CYP3A4 catalyzehydroxylation oflalpha,25-dihydroxyvitamin D(3): implications for drug-induced osteomalacia. MolPharmacol,2006,69(1):56-65.