文| 夙夜玖歌

编辑| 夙夜玖歌

前言

苹果是一种重要的经济果树，广泛生长在世界各地的温带地区。栽培苹果已从野生苹果中驯化，并与苹果杂交。栽培苹果和野生亲缘植物之间的表型差异在果实大小、味道和其他农艺性状方面是巨大的。性状变异的遗传来源主要归因于单核苷酸多态性和拷贝数变异。

然而，迄今为止，揭示与苹果重要性状相关的分子机制的研究主要集中在snp上，而CNV的信息尚未被探索。CNV是一种不平衡的结构变异，表现为长度为[7–9]且大于50 bp的缺失和重复。

CNV可以改变DN*片A**段的剂量，导致不同个体拷贝数的变化，进而可能影响基因表达水平和表型变异]。与SNPs相比，基因组中CNV的数量要少得多，但受CNV影响的碱基对总数明显高于SNPs 。因此，CNV是遗传变异的重要来源，可能影响群体遗传学中缺失的环节。

CNV调用过程和仿真评估

在苹果中进行了CNV鉴定，简单地说，采用了RP、SR和RD方法的策略。共收集了346份材料的1.56 Tb高质量的全基因组测序数据进行分析。将干净的reads与参考基因组“GDDH13第1.1版”进行比对后，平均深度为~7.2X，基因组覆盖率为~92%，表明其适用于CNV检测。

为了保证CNV检测的准确性，在苹果基因组中使用模拟的CNV来评估Speedseq的性能。Te结果表明，它能够在基因组学研究中常用的测序深度水平上检测到模拟的CNV.对于测序深度在5-10X之间，使用的方法可以分别获得~的65%和~的真阳性率。随着测序深度的增加，TPR的改善变得边缘，缺失和重复的~分别为84%和~为80%。

CNV基本总结

利用GDDH13参考基因组，共鉴定出346份材料中的914610个CNVs。每次登录的CNVs平均数量为2643，平均为2423个缺失和220个重复。为了保证识别cnv的可靠性，对读取映射进行了手动检查。在这里选择MdCBF2的5‘UTR中一个630 bp的缺失和一个覆盖MD15G139100的重复作为样本区域，以显示已识别的cnv的可靠性。

CNVR的分布和与SNPs的连锁分析

接下来将不同加入的cnv合并到cnvr中。共鉴定出14,839个CNVRs covering~71.19 Mb。这些CNVRs解释了参考基因组的for~10.03%。10个，他们被分为3种类型：13579个损失，1048个增加和212个两个事件。CNVRs的Te长度从109 bp到847 kb不等，平均为4.80kb。全基因组的CNVRs在各染色体上的分布，以及SNPs、TEs和基因特征如图所示，TEs和CNVRs的基因组分布似乎是一致的。

对于每个CNVR，考虑附近上下游的300个SNPs进行连锁不平衡（LD）分析。然后将cnvr分为低ld、中ld和高ld三类，如方法所示。绝大多数CNVRs（80%）表现出低LD，15%的CNVRs具有中等水平的LD，只有5%表现出高LD，可以被相邻的SNPs标记。预计，更常见的等位基因更常处于高LD状态，显示LD状态与CNVR MAF呈正相关。此外，在三种CNVR类型中，高ld、中ld和低ldCNVRs的比例相似。

CNVR可以准确地推断种群结构

CNVRs的系统发育分析表明，苹果材料可以清晰地分为品种和野生亲缘关系。邻域连接聚类分析表明，该品种位于野生材料附近，而该品种和品种形成了一个较大的分支.然后，我们将苹果材料的主成分分析（PCA）结果与从SNPs中推断出的群体结构进行了比较。虽然CNVs的PC1和PC2解释的方差（6.94%）低于SNPs（26.52%），但两种结果都可以区分品种和野生亲缘关系。

虽然基于snp的结果中的样本更为集中，但基于CNVR的PC1和PC2的样本跨度更宽。

不同品种和野生亲缘关系之间的CN分化基因

为了研究这两个苹果群体中CNVs注入的cn分化基因，计算所有品种与野生亲缘植物（这里仅保留ss和s）之间的Vst基因，并进一步分析位于Vst前1%的基因（图5A，B；附加fle 2：表S7）。在127个cn分化基因中，有17个被注释为R基因，其中大多数在野生亲缘基因中的拷贝数高于不同品种，这与野生材料具有较高的抗病性相一致。

例如，MD03G1049200（编码含有NB-ARC结构域的抗病蛋白，参与病原体识别和随后的先天免疫应答激活）与野生亲缘品种（平均CN=2.03）相比具有更高的CN（平均CN=3.92）。与对病原体的特异性免疫应答相关的典型抗性基因或外部不良刺激，如MD15G13091000也表现出类似的CN趋势。利用一个品种和两个野生材料的表达数据，我们还观察到MD15G1391000的表达水平随着拷贝数的增加而增加。

讨论

在过去的时间中，SNPs已经被广泛用于群体遗传学相关的研究。然而，SNPs研究发现的因果位点只解释了性状变异的部分遗传贡献，这导致了一种被称为“遗传力缺失”的现象。CNVs作为基因组变异的一个重要来源，有可能填补snp在群体遗传学中无法揭示的缺口。

在本研究中初步评估了Speedseq的性能，以确定其在CNV检测中的可用性。虽然没有检测到所有的CNVs，但该方法保持了极低的假阳性率（<1%）。仿真结果表明， 本策略能够以较高的精度检测出本工作数据中的大多数cnv 。据报道，与HFTH1基因组相比，MdCBF2的5‘UTR中有一个625 bp的CNV调控GDDH13参考基因组的冷驯化。

相应地在一些材料中发现一个630 bp的缺失，与金美味材料中的GDDH13基因组相比同时对MdCBF2周围的reads映射和CNV检测进行了人工检查，以确保结果的准确性，说明CNV检测策略是有效和可靠的。

然后将这些CNVs合并生成14,839个CNVRs，占苹果参考基因组的10.03%。首先探讨了CNVRs与TEs之间的关系。CNVRs与TEs之间基因组密度的Pearson相关系数为0.6（明显正相关），95.92%的CNVRs与TEs重叠，表明CNVRs在TEs内有一定程度的富集。

所得到的CNVR图谱也与SNPs进行了比较。与snp在染色体上的高度可变分布相比，CNVR的分布基本平坦，表现出两种变异类型的解耦。全基因组中CNVR和SNP的密度与局部不一致性呈显著正相关（r=0.58；p<2.2e-16）。

为了检验CNVRs与SNPs之间是否存在某种关系，对每个CNVR与附近的600个SNPs进行LD分析。类似于测试结果据其他研究报道，CNVRs通常与SNPs处于低连锁状态（即80%的CNVRs表现出低LD状态）。低LD状态可以归因于两个原因。首先，LD受到等位基因频率的影响，这反映在CNVR MAF与LD状态之间的正相关关系上，而偶联位点的等位基因频率的差异会导致它们之间的LD较低。

但近一半的CNVRs处于低等位基因频率（MAF≤0.05），而SNPs的MAF均大于0.05。CNVRs和snp的不匹配等位基因频率很可能是导致低LD的原因之一。另一方面，局部区域内的SNP密度可以解释低LD，CNVs在基因组的片段复制区域内富集，其中缺乏SNPs 。

Cooper等人和麦卡罗尔等人在他们的人类CNV分析中使用了不同的SNP集，导致CNVs和SNPs之间存在不同的LD状态。

在研究中，SNPs和CNVRs的密度存在轻微的不一致，，这也可能影响低LD状态。需要进行后续研究来彻底阐明CNVs和snp之间的关系。综上所述， 作为一种尚未全面描述的遗传变异，有可能与独立于snp的重要性状发生关联。 只有在至少10个个体中出现的CNVR被用于后续的功能和群体遗传学分析，从而最大限度地减少了序列覆盖深度的一致性和罕见CNVR的影响所造成的偏差。

不同品种和野生亲缘关系之间的CN分化基因

在本分析中只考虑这两个物种的野生亲缘关系。利用Te统计量Vst来鉴定不同品种和野生亲缘植物之间的差异基因。它是专门设计来测量CNV水平上的种群分化，从0到1，分别代表没有分化和完全分化。Vst的计算方法如下：

式中，Vtotal为所有苹果材料中CNVnator测量的拷贝数的总方差，Virvarars为所有品种间的拷贝数方差，Vwild亲缘关系为所有野生亲缘关系间的拷贝数方差。N品种和N野生亲缘关系分别为品种和野生亲缘关系的样本量；Ntotal为总样本量。使用CNVnator获得的CN估计数计算所有基因的Tus Vst。

结论

在本研究中，对野生苹果和栽培苹果进行了全面的CNV分析。共鉴定出14,839个CNVRs，占苹果基因组的10.03%，并基于346份苹果材料构建了CNVs综合图谱。 CNVRs和snp之间的LD较低，表明CNVs在很大程度上是独立的遗传变异资源。

与CNVRs重叠的基因主要在防御反应、繁殖等代谢过程中富集。一些重叠CNVRs的基因在品种和野生亲缘关系之间高度分化，这似乎与它们之间的一些性状差异有关。为了确认它们的遗传关联，需要在后续研究中进行功能验证。这些信息将为全面了解苹果的基因组变异提供重要的资源，并可能为今后对苹果及其近缘物种的基因组研究提供有用的参考。