文/编辑：亨霖研究所
一、
研究背景
萝卜(萝卜长度2n = 2x = 18)是十字花科的一种重要的世界性根菜作物。肉质主根是萝卜的主要产品器官，决定着萝卜的最终产量和品质，肉质主根中含有丰富的营养物质，包括碳水化合物、粗纤维、维生素C和蛋白质。
目前，已经在一系列植物物种如拟南芥中对根发育的分子机制进行了广泛的研究，*草烟**，玉米，和大米然而，在根菜类作物如萝卜中，主根增厚的分子机制仍远未完全阐明。
在过去的几十年中，随着“组学”方法的快速发展，RNA-seq已经成为系统鉴定几种植物物种不同组织、器官和发育阶段中差异调节基因、miRNAs和调节途径的有价值的策略，例如蔷薇 , 大豆 , 甜橙 , 杨梅 , 番茄茄，以及R.大蒜。
此外，现有的萝卜基因组数据库为研究萝卜主根增厚的分子机理提供了一个有用的基因组信息平台。
近年来，人们对萝卜主根增厚过程中的基因表达和复杂调控网络进行了大量的研究。使用RNA-Seq技术，许多miRNAs和转录物被鉴定为在萝卜主根增厚过程中差异表达，碳水化合物代谢途径在主根增厚过程中被显著激活，尤其是在细胞增殖组织中。
然而，以往的研究主要集中在单个萝卜品种上，不同根型萝卜基因型中参与萝卜主根增厚的关键基因仍有待准确识别，越来越多的证据表明，根的形状和大小(根型)在不同品种间存在显著差异。
与根型差异相关的基因被认为是促进或抑制萝卜主根加厚的候选基因，迄今为止，还没有鉴定不同品种主根发育相关基因的报道，这限制了萝卜品种的遗传改良和种质创新。
为了鉴定参与主根增厚的差异表达基因(DEGs)和差异表达miRNAs (DEMs)，本研究使用了三个具有不同根形状和大小的高级自交系，包括萝卜‘NAU-DY’(大针状)、‘NAU-YB’(中等倒卵形)和‘NAU-YH’(小圆形)。
在三个高级自交系的主根加厚的三个发育阶段进行了整合的mRNA-seq和sRNA-seq分析此外，进行RT-qPCR分析以验证几个重要候选基因的表达模式，本研究结果可揭示主根增厚的关键基因和miRNAs，并为萝卜主根增厚的动态调控提供新的见解。
二、
研究讨论
整合mRNA-序列和sRNA-序列的方法为发掘潜在的关键基因和揭示复杂的性状调控网络提供了有价值的工具，萝卜主根增厚是一个复杂的生物过程，包括一系列物质积累和信号转导途径。
迄今为止，萝卜主根形成的分子机制仍未完全揭示。为了进一步了解萝卜主根形成的分子机制，本研究对三个萝卜高级自交系主根增厚过程中的mRNA-序列和sRNA-序列进行了整合分析。
由于肉质根的大小不同，本研究使用了三个具有代表性的萝卜高级自交系。“NAU-DY”和“NAU-YB”之间共有2606个deg，而“NAU-YH”和“NAU-DY”之间共有16个DEMs，12个DEMs在“NAU-DY”*特中**异性差异表达。
此外，几个关键基因包括SUS1, EXPB3，以及CDC5通过RT-qPCR分析进行表征和描，本研究系统地报道了利用mRNA-序列分析和sRNA-序列分析相结合的方法对三个萝卜高级品系中参与主根形成的潜在关键基因进行分析。
与根型差异相关的关键基因
与根型差异相关的基因被认为是促进或抑制萝卜主根增厚的候选基因，使用抑制性消减杂交(SSH)在瘦型根和厚型根中分别鉴定了总共140个和70个特异性表达的基因。
参与类苯丙酸代谢的几个基因在细根型品种中过量表达，类苯丙酸是木质素合成的前体，表明木质素生物合成途径参与萝卜主根增厚。
此外，与乙烯产生和根毛伸长相关的基因也在瘦型根中过表达，其原因可能是乙烯和侧根发育抑制了细胞膨胀和主根伸长，因此，细根和粗根品种间的差异可能与根型变异有关。
在这项研究中，共有12个属于miR165，miR167，miR319，miR5658，miR8175，miR857，miR170和miR393家族的DEMs mirna在大针状萝卜‘NAU-DY’主根加厚期间特异性差异表达，这可能与根型变异有关。
另一方面，许多DEGs被鉴定为在“NAU-YH”和“NAU-DY”之间特异或共同表达例如，参与淀粉和蔗糖代谢的基因包括蔗糖合酶4(SUS4)，蔗糖磷酸合酶2(SPS2)，以及6-磷酸果糖激酶(FK1, FK7)具体表达在“NAU-DY”，而SUS1，蔗糖合酶3(SUS3)、蔗糖转运蛋白(SUC1, SUC2)，蔗糖磷酸合酶2(SPS1)，以及6-磷酸果糖激酶(FK3, FK6)共同表达在“NAU-迪”和“NAU-YH”。
mRNA和sRNA结果的关联分析显示miR167c-5p(靶向于ARF8)，miR393a-5p(针对bHLH77)，miR5658(针对APL语言)被鉴定为在‘NAU-DY’萝卜主根加厚期间显著差异表达，表明miR393-bHLH77，miR167-ARF8，以及miR5658-APL语言(MYB的一员)可能在萝卜主根加厚中起关键作用。
SUS1和CDC5可能有助于萝卜主根的增厚
碳水化合物代谢在加厚根中被显著激活，特别是在细胞增殖组织中，其中SUS1与根系增粗率有关。
在这项研究中，GO术语“碳水化合物代谢过程”(GO: 0005975)被萝卜主根增厚的任何比较对显著丰富和共享，而不考虑根的大小，这与萝卜的先前报告一致，表明碳水化合物代谢可能对主根增厚至关重要。
有趣的是，在这些参与碳水化合物代谢过程的基因中，SUS1基因在三个萝卜高级自交系中表现出不同的表达模式。
对于大针状萝卜，表达水平为SUS1(Rsa1.0_00483.1_g00003.1)在皮层分裂期达到高峰，远高于中倒卵形和小圆萝卜(FD536105)。
此外，SUS基因对马铃薯块茎形成的发展具有重要意义，番茄水果设置，胡萝卜根形成，玉米籽粒形成，小麦籽粒形成，和水稻籽粒形成。
本研究中，RT-qPCR验证结果表明SUS1在CSS中显示高表达模式，特别是在“NAU-DY”中，表明SUS1可能在主根增厚过程中起着至关重要的作用，特别是对于大针状萝卜而不是小圆形萝卜的增厚。
CDC5是一种细胞周期调节因子，编码一种MYB相关蛋白。最近，越来越多的报道称AtCDC5对控制植物生长和发育的miRNAs积累起正向调节作用。
同时，CDC5基因对细胞周期中的G2期至关重要，G2到M期(G2/M)的转变受基因的影响AtCDC5-RNAi转化体，以及AtCDC5-VIGS转化体在抽薹和加速细胞死亡之前死亡。
有趣的是，CDC5无论用RNA-seq还是iTRAQ-seq方法，都发现在萝卜主根加厚过程中表达上调，这将在萝卜主根加厚的细胞分裂中起重要作用。
在本研究中，RT-qPCR验证结果与先前的研究结果大致一致CDC5在胚胎干细胞中表现出高丰度，这些结果初步表明CDC5可能在萝卜主根加厚的生长发育中起重要作用。
COBRA可能是萝卜主根细胞伸长所必需的
植物的生长和发育是通过一系列有针对性的细胞分裂和细胞膨胀来促进的，植物细胞壁为植物体提供基本的机械支持，并决定细胞的大小和形状。
纤维素微纤丝组织作为细胞壁的主要成分，是细胞膨胀的决定因素之一。
在这项研究中，GO术语“纤维素微纤丝组织”(GO: 0010215)在“NAU-DY”和“NAU-YB”之间的S3与S1配对比较中显著丰富，总共两个蛇形机器人“眼镜蛇”第三眼镜蛇状的基因包括COBL2, COBL5和COBL8被鉴定为差异表达。
先前的研究表明蛇形机器人“眼镜蛇”参与纤维素的合成，控制植物细胞壁中纤维素的含量和细胞定向伸长的功能。
有趣的是，在这项研究中，所有蛇形机器人“眼镜蛇”基因被上调，而所有的眼镜蛇状的在“NAU-DY”和“NAU-YB”之间的S3对S1配对比较中，基因是下调的，这表明蛇形机器人“眼镜蛇”可能在萝卜主根加厚的细胞伸长中起关键作用。
三、
研究基因
萝卜主根增厚具有复杂的分子调控机制一般来说，参与形态发生的物质包括蔗糖、淀粉和蛋白质是萝卜主根形成和发育不可缺少的，一系列基因(例如SUS1, SUS3, SUC1, SUC2)参与了这些过程。
其中，SUS1可能有助于根长而粗的萝卜主根增厚，参与植物激素生物合成和信号转导的基因包括生长素(例如SAUR40, IAA26, IAA3, IAA7)，CTK(如日志8, CKX6)，以及GA(例如GA2ox1, GA3ox2, RGA2)可能是萝卜主根加厚信号转导过程中的重要调节因子。
细胞周期由F-box蛋白调节(例如cycu 4–1, cycd 3–1, CDC5)和细胞周期蛋白依赖性激酶(例如KRP5) ，这可能决定了萝卜主根增厚的细胞数。
细胞扩张由扩张蛋白调节(例如EXPA9, EXPB1/3)、木葡聚糖内切葡聚糖酶/水解酶蛋白(例如XTH9, XTH7)，以及根细胞延伸因子(例如蛇形机器人“眼镜蛇”) ，这可能决定了主根加厚过程中细胞的大小。
此外，一些转录因子(TFs)被发现参与其他植物的根发育，包括水稻和水稻拟南芥和一些TF，包括bHLHs(例如miR393-bHLH77, bHLH96, bHLH148)，MYBs(MYB4, MYB28, MYB44)，以及WRKYs(例如WRKY12, WRKY19, WRKY33)在本研究中被鉴定，表明它们可能在萝卜主根加厚中起关键作用
共有45个共享基因在三个不同根大小的高级近交系中差异表达，其相应的表达模式见图，5a.结果表明大多数deg共享相似的表达模式，而一些deg(例如SUS1, SUC1, EXPB3, EXLA2，以及ERF109)表现出不同的表达模式。
有趣的是，赤霉素3氧化酶2(GA3ox2),细胞分裂素氧化酶6(CKX6)，miR167c-5p(针对ARF8)，以及miR393a-5p(针对bHLH77)在‘NAU-DY’*特中**异性差异表达，基于这些结果，提出了萝卜主根加厚和发育的推定调控模型。
简而言之，蔗糖(蔗糖代谢的关键基因:SUS1)作为信号分子可以诱导miR393-bHLH77特定表达式，然后调控下游基因(CYCs)在萝卜主根加厚过程中的细胞分裂中起重要作用。
一些参与生长素生物合成和信号转导的基因(miR167-ARF8)，CTK(CKX6)和GA(GA3ox2)也调控了几个功能基因(蛇形机器人“眼镜蛇”, EXPB1/3, CDC5)，表明它们可能在启动萝卜主根加厚和发育中起作用。
结论
这是首次对三个萝卜高级自交系主根增厚过程中转录组和miRNA的综合分析。在‘NAU-DY’和‘NAU-YB’之间共有2606个DEGs，它们在‘类苯丙酸生物合成’、‘硫代葡萄糖苷生物合成’和‘淀粉和蔗糖代谢’途径中显著富集。
同时，在‘NAU-DY’和‘NAU-YH’之间共有16个DEMs，而在具有大针状根的‘NAU-DY’中，与具有小圆形根的‘NAU-YH’相比，有12个miRNAs在主根加厚期间显示出特异性差异表达。
DEMs和DEGs之间的关联分析表明miR393-bHLH77，miR167-ARF8，以及miR5658-APL语言可能与萝卜的根型变异有关，此外，RT-qPCR验证结果表明，评估的DEGs/ DEMs与RNA-Seq数据高度一致。
这些发现将为全面理解萝卜主根增厚的分子调控机制提供有价值的信息，并有助于根菜类作物的进一步遗传操作和品质改良。
