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摘要
这种快速的方法可以从本氏*草烟**叶片中提取叶绿体富集的蛋白，叶绿体富集的蛋白被瞬时转化为表达一个感兴趣的表位标记蛋白。因此，当它与Western blot分析相结合时，可以作为研究相关蛋白叶绿体定位的工具。
农杆菌介导的转化(Agroinfiltration, Romeis et al., 2001)可以在*草烟**叶片中瞬时表达携带表位标签的蛋白。另外，与含土壤传播小麦花叶病毒19K的农杆菌菌株共渗透可以抑制转录后基因沉默，从而提高转化效率 (Te et al., 2005)。
转化叶片的叶绿体分离方法是基于Romeis等人（2001）稍作修改后的方法，包括细胞壁和细胞膜的机械破裂，过滤去除未破碎的组织，以及通过Percoll层离心分离完整的叶绿体。
材料和试剂
1. 本氏*草烟**植株；
2. 携带重组双元质粒的根癌农杆菌（ A.tumefaciens ）菌株GV3101，其中感兴趣的基因融合在表位标签上；
3. 携带19K的农杆菌GV3101；
4. 胰蛋白胨（AppliChem GmbH，产品目录编号：403682.1210 ）；
5. 酵母膏（AppliChem GmbH，产品目录编号：A1552,0500 ）；
6. 蔗糖（AppliChem GmbH，产品目录编号：A2211,0500）；
7. MgSO4（默克公司，目录编号：105886）；
8. 适当的抗生素；
9. 琼脂（卡尔·罗斯，目录编号：2266.2）；
10. 乙酰丁香酮（Sigma-Aldrich，目录编号：D134406）；
11. MES缓冲液（卡尔·罗斯，目录编号：4256.3）；
12. 液氮；
13. 细胞分离液（通用电气医疗保健，目录编号：17-0891-01）；
14. 乙二胺四乙酸二钠（EDTA）（卡尔·罗斯，目录编号：8040.1）；
15. 二硫苏糖醇（DTT）（产品目录编号：A2948）；
16. MgCl2（默克公司，目录编号：105833）；
17. 甘油（AppliChem GmbH，产品目录编号：A3739,0500）；
18. 羟乙基哌嗪乙硫磺酸（卡尔·罗斯，目录号：9105）；
19. 山梨醇（默克公司，目录编号：56755）；
20. 牛血清白蛋白（卡尔·罗斯，目录编号：8076.2）；
21. 无EDTA蛋白酶*制剂抑**（罗氏诊断公司，目录编号：11 836 153 001）；
22. YEP培养基（见配方）；
23. 混合剂缓冲液（见配方）；
24. 分离缓冲液（见配方）；
25. 蛋白提取缓冲液（见配方）。
设备
1. 1ml注射器（Terumo医疗公司，目录编号：BS-01H）；
2. 4°C冷冻离心机；
3. 47μm尼龙网（卡尔·罗斯，目录编号：XA63.1）；
4. 2ml圆底玻璃均质器（A. Hartenstein，目录编号：HOG2）；
5. 带有相位反差聚光镜和相位反差兼容物镜的光学显微镜，如物镜LD A-Plan 40x/0.5 Ph2（ZEISS）；
6. 恒温振荡培养箱；
7. 旋转摇荡器；
8. OD600光谱仪；
9. 1.5ml反应管（SARSTEDT AG，目录编号：72.706）；
10. 50ml锥形离心管（SARSTEDT AG，目录编号：62.548.004）。
步骤
1.本氏烟的瞬时转化
（1）将含有19K的农杆菌GV3101和携带目的基因（带有表位标签）载体的农杆菌GV3101分别在含有适当抗生素的YEP琼脂平板上划线。在28℃下孵育48h，获得单克隆。
（2）将培养不超过1周的培养皿中的单个菌落接种到含有15ml YEP培养基（含有适当的抗生素）的50ml离心管中，在28°C、180rpm的条件下过夜。
（3）第二天，将过夜培养物（OD600在1.0~1.5之间）在室温下以2500× g 离心10min，舍弃上清液。
（4）将离心收集的农杆菌重新悬浮在5ml混合缓冲液中。
（5）室温条件下，在旋转摇床上以120rpm的转速暗培养2h。
（6）将两种细菌悬液（19K、目的基因）混合，前者20%、后者80%，最终OD600在0.5至1.0，用于目的基因的瞬时表达。
注：由于19K抑制基因沉默，侵染混合物中19K的比例已被证明可以有效地增强几种蛋白的瞬时表达。然而，对于其他蛋白质的最佳比值可能会有所不同。侵染混合物OD600高于1.0可能导致对*草烟**的毒性影响。
（7）将无针头注射器的尖端压到3-4周龄、水分充足的下叶表面，注射混合菌液。用第三、第四和第五个的叶片进行农杆菌侵染（图1A）。每一片叶子一次注射100-150µl的混合物。用记号笔标记叶片上的浸润区域（图1B）。
注：在农杆菌侵染的第一天早晨给植物浇水是很重要的。否则，农杆菌很难在不破坏组织的情况下成功渗入叶片组织。
图1 农杆菌侵染过程。数字为3、4和5的叶片最适于农杆菌侵染，侵染区域用记号笔做了标记。
2.瞬时转化本氏烟叶绿体的分离
说明：为了获得完整的叶绿体，应在暗循环结束时从*草烟**植株中收获植株材料，并将其保存在黑暗中，以避免在离心过程中过量积累淀粉，导致叶绿体外壳破裂。此外，所有实验步骤都应在4℃条件下进行。
（1）在农杆菌侵染2-3天后，将瞬时转化的植物材料，用预冷玻璃均浆器在400μl冰分离均质液中均质。
（2）匀浆通过47μm的尼龙网过滤，并在冰上和黑暗中保存。
（3）40% Percoll层的制备：将132µl的Percoll层与198µl的分离缓冲液彻底混合，将40%的Percoll层沉积在1.5ml反应管的底部。
（4）将400µl含有匀浆的过滤叶绿体小心地放置在40% Percoll层上，在4°C，7000× g 条件下离心1min。完整的叶绿体将以绿色的颗粒沉积，而破碎的叶绿体仍然在Percoll层的顶部（图2）。
注：1.另外，完整的叶绿体的离心也可以在1700× g 下更温和地离心6min。
2.弃上清液，将叶绿体在小体积（20-30µl）的分离缓冲液中轻轻重悬浮。富含叶绿体的悬浮液保存在冰上。
图2 通过40% Percoll层离心后从完整的叶绿体中分离。
（5）用相差显微镜证实了颗粒状叶绿体的质量。完整的叶绿体显得不透明，周围有一个光晕（图3A）。破碎的叶绿体表现出深绿色、颗粒状和无折射的外观。
图3 在相差显微镜下可见完整的叶绿体和破碎的叶绿体。
（6）随后，以4°C、1000× g 离心5min，使叶绿体成球，取出并丢弃上清液。
（7）在液氮中休克冷冻叶绿体。
（8）冷冻断裂的叶绿体在50µl冰冷蛋白提取缓冲液中重新悬浮，4°C、15000× g 离心10min。
（9）将上清液（含有可溶性叶绿体蛋白）转移到一个新的离心管中。
（10）富含不溶性叶绿体蛋白的颗粒在50µl冰冷蛋白提取缓冲液中重新悬浮。
（11）样品可以保存在-70℃或直接用于Western blot分析，以比较叶绿体部分和瞬时转化*草烟**叶片总粗提物中的蛋白表达。
注：从100mg叶片材料中分离的叶绿体蛋白的总产量在10-20g之间。5-10g可用于Western blot分析。
配方
1.YEP培养基
0.5%胰蛋白胨（m/v）
0.5%酵母膏（m/v）
0.5%蔗糖（m/v）
50mM MgSO4
固体培养基：加入1.5%琼脂（m/v）
对YEP培养基进行高压灭菌
2.混合缓冲液（必须新鲜配制）
10mM MES（用1M KOH调整pH值为5.8）
10mM MgCl2
150μM乙酰丁香酮
3.分离缓冲液（必须新鲜配制）
0.33M山梨醇
50mM 羟乙基哌嗪乙硫磺酸（用1M KOH调节pH为7.0）
0.1%（m/v）牛血清白蛋白
2mM EDTA
1mM MgCl2
4.蛋白提取缓冲液（必须新鲜配制）
10%（m/v）甘油（来自高压灭菌原液）
5mM EDTA（来自高压灭菌原液）
10mM DTT
100mM HEPES（用1M KOH调节pH为7.2，无菌过滤）
蛋白酶*制剂抑**
References：
1.Pineda, M., Sajnani, C. and Baron, M. (2010). Changes induced by the Pepper mild mottle tobamovirus on the chloroplast proteome of Nicotiana benthamiana . Photosynth Res 103(1): 31-45.
2.Romeis, T., Ludwig, A. A., Martin, R. and Jones, J. D. (2001). Calcium-dependent protein kinases play an essential role in a plant defence response. EMBO J 20(20): 5556-5567.
3.Te, J., Melcher, U., Howard, A. and Verchot-Lubicz, J. (2005). Soilborne wheat mosaic virus (SBWMV) 19K protein belongs to a class of cysteine rich proteins that suppress RNA silencing. Virol J 2: 18.