文|胡一舸

编辑|胡一舸

前言

富营养化水体中的 蓝藻水华 频发，造成了巨大的生态风险，已经引起了人们的高度重视。

水华不仅会导致水质恶化，自净能力下降，还会对自然环境和文化景观 造成严重影响， 而且还会产生大量的有毒藻类，严重威胁着人们的身体和生命安全。

蓝藻毒素是由产毒的蓝藻所形成的一类次生代谢物，它具有多种毒性，尤其是 肝*毒脏**性和神经毒性。

微囊藻毒素是一种常见的藻种，它是一种被研究最多的藻种。鱼血红素是一种由诸如 鱼血红蛋白、海带等海藻 所分泌的一种神经毒物。

麻痹性贝毒是一种小分子生物碱，它是亚历山大藻属、束丝藻属、鱼腥藻属等海藻分泌的一种重要的 生物碱类化合物。

由于其种类繁多、难以提取、痕量变化大、检测复杂等特点，导致其污染严重，导致其污染和健康风险 难以得到有效防控。

现有的蓝藻毒素分析技术对样本和环境的需求较高，通常仅能对水中 已经产生并累积到某一水平 的毒素进行测定，不能对其产量、种类及产毒藻种等做出预测。

近年来，基于藻毒素合酶组分基因的研究表明，藻毒素的生物合成主要由 mcy基因簇、ana基因簇和sxt基因簇共同调节， 为有目标地监控和研究产毒蓝藻奠定了基础。

笔者利用复合PCR和HPLC方法，对124个环境样本进行了检测，发现 复合PCR的灵敏度为92.3%，特异性高达100%。

之后利用PCR技术，以37个藻种为材料，对其产毒性能进行了测定，其中18个菌种的 PCR结果为阳性。

再利用套式PCR的方法，对环境样本中的 鱼腥藻毒酶基因anaC进行了扩增， 结果显示这种方法的扩增效果非常明显，并且还发现anaC基因在淡水湖泊中有着 非常广泛的分布。

我们应用sxtA基因PCR技术，对从德国东北地区一个湖泊中获得的14个产生麻痹性贝毒素的菌种进行了PCR分析，发现 14个菌种的样品全部为阴性。

该技术简便、快速、高灵敏、廉价，可实现在水华发生前对其进行 快速、准确的定量测定， 提高了水华毒性的早期预警、预报和防治水平，有着广泛的应用前景。

云南滇池是云南高原最大的淡水湖，也是全国最具代表性的 富营养化湖泊， 滇池周边海域在2017年经历了大量的蓝藻水华暴发。

开展富营养水体中毒性蓝藻及毒性藻类的 遗传基础的解析， 可为准确评估毒性藻类的生态风险、构建毒性藻类的早期早期预警手段、减少毒性藻类的危害等方面的应用奠定基础。

样品采集和处理

自2017年三月至2018年二月，在滇池海埂海域3个采样点，每个采样点深度为0.5米，底部2米，并对采样点的 水温、pH值及透明度 进行了测量。

将上、下两个样品进行充分的混合，用0.45微米、0.22微米的光纤滤膜对藻类进行分离，并在-40℃下进行 贮藏。

笔者以昆明硕擎生物技术有限公司为研究对象，以产毒蓝细菌中所含的mcyE，鱼腥藻中所含的AnaC和sxtA为代表的三种海藻中所含的毒力因子；

通过 PCR方法 测定其DNA的含量，获得了相应的DN*片A**段，并对所含DN*片A**段进行了比较（表1）。在94℃下进行5分钟的预变性，在94℃下进行30秒的热处理

利用凝胶循环技术对目标基因序列进行 分离， 利用pEASY-T1CloningKit技术将目标基因序列分离到LB平板上。

并在LB板上随机选取一株细菌，通过振动法分离得到的细菌，经昆明硕擎技术有限公司对其进行 序列测定。

经过NCBIBLAST比对之后，再与GenBank数据库中 mcyE、anaC和sxtA基因 的参考序列相关联。

使用ClustalX1.83软件将所有序列进行了匹配安排，使用MEGA6.0软件中的NJ法，分别建立了 系统进化树， bootstrapvalue设置为1000。

滇池海埂水域藻毒素基因PCＲ扩增及克隆测序

采用常规PCR方法对滇池海埂水体中的 蓝细菌DNA进行了常规PCR检测， 如图1所示。结果显示，在滇池海埂水体中，mcyE、anaC和sxtA基因在812、861和683个碱基上都出现了显著的荧光条带；

说明已从该三个基因中分离得到了 mcyEs基因的有效序列，anaC基因的高效序列，以及sxtA基因的有效片段。

分离到184个mcyE蛋白序列，其中春季55个，夏季50个，秋季40个，冬季39个，历时1年。

对获得的184个mcyE家族成员进行DNA测序，并与 典型mcyE家族成员 进行比较，建立mcyE家族成员的亲缘关系。从图2可以看出，在演化树中，全部的基因都可以分成3个演化群落。

ClusterI中包含了青绿两种藻种的mcyE基因，笔者在前期工作中得到了184个mcyEs基因，提示滇池海埂水体中的MCs很有可能是MCs的重要来源。ClusterⅡ包括席藻属和浮丝藻属mcyE基因 参考序列。

ClusterIII包含了鱼腥藻属、费氏藻属、软管藻属、念珠藻属和节球藻属的mcyE基因参考序列。群集二至三没有包含笔者的 调查样品顺序。

据此推测，滇池海埂水体中的mcyE家族成员具有 相对单一化 的特点，以产毒性的微囊藻为主，并具有一年四季的分布特点。

而在研究区共得到了142个活性序列，其中春季有53个活性序列，夏季有44个活性序列，冬季有45个活性序列，但秋天没有发现。

通过比较142个AnaC的片段和经典的AnaC的片段，建立了一个 新的进化树。 从图3可以看出，在演化树中，全部的基因都可以被分成3个演化群组。

我们所获取的AnaC基因参照序列及已获取的142条AnaC的全长序列，对ClusterI进行了克隆。

并将我们所获得的anaC的一部份与尚未获取的AnaC的参照序列共同构成了一个进化亚簇A，而我们尚未进行过培养的蓝细菌与已获得的 anaC的序列具有很高的相似性；

另外，与束毛藻、长杆毛藻同属的AnaC基因相比，长杆毛藻是一个新的类群，而长杆毛藻是一些束毛藻分类的一个新的类群，其 起源地可能是束毛藻。

簇II包含了一组来自于鱼腥藻科的AnaC基因的参照序列。ClusterIII包含了颤藻类中anaC的一个参考序列。

群集二至三没有包含笔者的 调查样品顺序。 这说明研究区的AnaC基因以束丝藻为主体，除了秋天，其它时间都有AnaC的表达。

麻痹性贝类毒素sxtA基因系统进化分析

在研究区共得到了195个麻痹性贝毒素sxtA的活性序列，其中春、夏、秋、冬各期都检测到了，且在一年四季中都能检测到。

通过对195个sxtA的全基因组测序和经典的sxtA的参考序列进行比较，建立了 sxtA的分子进化树。 从图4可以看出，在演化树中，全部的基因都可以被分成4个演化群组。

ClusterI包含了笔者所获取的195个已知的麻痹性贝毒sxtA和BrassicasxtA的参照序列，其同源度99%。ClusterII包含了sxtA基因的一个参照序列，其中sxtA是拟柱胞藻类中一个重要的转录因子。

其中包含了一个壳球菌的sxtA基因的参考序列。群集II至IV中没有包含作者所做的样品。据此推测，研究区的sxtA基因以束丝藻为主体，而且是一年四季都有的。

讨论

笔者拟以云南地区滇池海埂水体中产生的有毒蓝藻为研究对象，以mcyE、anaC、sxtA等为研究对象，利用PCR技术对其产生的 毒性进行鉴定。

在滇池海埂水体中，从2017年3月份一直到2018年2月份，都有mcyE的检出。前期研究发现，滇池海埂水体中McyE与Cu-Cu-Glycospinum有99%的同源关系，滇池海埂水域微囊藻毒素主要由 微囊藻属水华蓝藻产生。

鲍忠祥等人通过HPLC测定和微量统计得到的 优势居群， 在滇池中也有大量的藻类，而且这些藻类以藻类为主，我们的前期工作也证实了这一点。

结果表明，滇池海埂水域的光照条件、水温和弱碱性的pH值对其有较好的影响。滇池蓝藻水华以微囊藻水华为主，微囊藻已成为滇池蓝藻水华的优势种群，这可能导致mcyE基因 多样性较为单一， 遗传差异性不明显。

鱼腥藻毒是一种神经毒性物质，也是一种对人体和动物造成严重伤害的物质。当前关于水华藻类毒素的相关报道主要集中在 微囊藻毒素 方面，而其它种类水华藻类毒素的相关报道很少。

应进一步加大对其它生物毒物的研究力度，以构建较为完整的海带生物毒物研究系统。笔者在滇池海埂海域中发现了一种能产生 麻痹性贝毒性的毒团球菌和产生鱼腥藻球菌毒性 的毒团球菌。

研究区在2017年3-2018年2个季度的水样中检测到了sxtA的表达，但在2017年秋天未检测到anaC的表达，推测与 藻毒素降解、生物吸收及生态条件 等相关，但其中的机制尚需深入探讨。

并且，我们对滇池丛生藻水华进行了动物实验，结果表明 丛生藻能够引起瘫痪性贝毒素的生成。

结语

由于水体中普遍含有大量的蓝藻，因此对水体中产生的毒性蓝藻进行监测和藻类毒素分类研究，对水体中产生的毒性蓝藻进行 准确、快速和有效的预警 是十分必要的。

滇池是全球最大的水体之一，其水体中大量的藻类，其水体中的 藻类毒性 是一个不可忽视的问题。

我们前期通过16SrRNA和18SrRNA高通量测序，对滇池海埂水体中的 原核型和真核型 进行了系统的调查；

结果表明：春、夏、秋、冬四个季节中，以微囊藻为主的研究区域内，同时也有其它种类如 束丝藻 的分布，这将为下一步开展 产毒型蓝藻的分子生物学鉴定工作 奠定基础，并为建立产毒型蓝藻的早期预警机理奠定基础。

由于滇池的水体生态状况和水体的富营养化水平均有较大的差别，因此，笔者拟开展的工作将有助于对其毒性蓝藻的物种组成和分布特征进行 系统的分析。

目前，单一的基于毒性蓝藻的分子生物测定技术很难准确地反应出 水华的藻类毒性， 需要将 HPLC、ELISA等特定的毒素测定技术与ELISA技术 联合运用。

参考文献：

［1］兰文升，张锐，贺秀媛，等《麻痹性贝类毒素研究进展》

［2］方红云《浅析滇池蓝藻暴发原因》

［3］郑丙辉，彭嘉玉，胡小贞，等《2017年滇池外海水质异常下降原因及对策》

［4］吴忠兴，虞功亮，施军琼，等《我国淡水水华蓝藻－束丝藻属新记录种》