文丨初八没烦恼
编辑丨初八没烦恼
高等植物中，含有大量的非特异性脂转移蛋白，即nsLTP， 并且nsLTP具有富含半胱氨酸、分子量小、以及可以在膜间转移等特点。
植物的nsLTP具有保守的特征：8个半胱氨酸形成4个二硫键，即Cys1-Xn-Cys2-Xn-Cys3Cys4-Xn-Cys5XCys6-Xn-Cys7-XnCys8。
迄今为止，已在50多个物种中发现100多种潜在的植物nsLTPs。nsLTPs可以与各种疏水分子可逆地结合并运输，这些疏水分子负责植物细胞中，生物膜或不同细胞器间的脂质运输。
此外，nsLTP被证明涉及到表皮蜡的合成。例如，表皮细胞中的nsLTP基因高表达，nsLTP还能将一些脂质单体运输到细胞蜡的合成位点。
杨树是一种多年生落叶乔木，在北半球被广泛种植，其用途广泛，可作为木材和工业用材。
虽然nsLTPs已被研究多年，但杨树nsLTPs的功能尚不清楚。根据其结构、功能、表达分析， nsLTPs可能在杨树生长发育过程中，发挥重要的生理生化作用。
实验的材料与方法
使用ExPasy，确定杨树nsLTP蛋白的编码序列长度、蛋白质氨基酸数量、蛋白质分子量、等电点等。
从NCBI数据库*载下**杨树、拟南芥、玉米等，三十种植物的nsLTP蛋白的全长氨基酸序列数据。
使用ClustalX进行nsLTP蛋白序列比对，通过MEGA7.0软件构建系统发育树， 采用邻居连接方法，共1000次bootstrap重复。 另外使用SWISS-MODEL和Chimera软件，进行蛋白质三维空间结构的预测。
在37℃条件下，使用BamHI和NotI两种限制性，内切酶对目的基因DN*片A**段和pGEX4T-1质粒分别进行0.5h双酶切。
酶切产物使用PCR产物纯化试剂盒进行胶回收。随后利用T4DNA连接酶将PtLTP基因与pGEX4T-1线性化载体在16℃下过夜连接，构建pGEX-4T-1-LTP重组表达载体。
次日将pGEX-4T-1-LTP载体，转化至大肠杆菌Arctic-ExpressTM，使用含50μg/mL氨苄青霉素的LB平板，37℃倒置培养过夜。 挑选单克隆菌落，双酶切验证并测序。
所用的杨树放置在在密闭培养室内，使用MS培养基，光暗节律为16小时光照/8小时黑暗，保持培养室温度在25℃，待生长两个月后移植到与灭菌泥炭和珍珠岩2：1混合的土壤中。
分别对杨树嫩叶、成熟叶、上部茎、下部茎和根等不同组织，进行取样以探究组织特异性。
为探究PtLTP基因对非生物胁迫处理的响应，采用200μmol/LABA、2mmol/LH2O2、200mmol/LNaCl分别对杨树进行胁迫处理。
在处理后0、1、3、6、8、12、24、48h收集杨树叶片，其中以0h作为对照，每个样品重复三次。样品被采集后迅速放入-80℃液氮中储存，为后续提取RNA做准备。
实验结果分析
通过拟南芥信息资源TAIR，查找有关nsLTP基因的信息。利用带有Pfam结构域的脂质转移蛋白，筛选杨树蛋白质组序列。
其中NCBI参考序列为XP_006387199的PtLTP蛋白，长度是118个氨基酸残基。 预测其蛋白质分子量为11.81KD，PI值为9.22。
其中有四种氨基酸含量较为显著：Ala、Ser、Leu和Gly，分别占13.6%、15.3%、11.9%和10.2%。
使用Clustalx软件，对包括毛果杨、拟南芥、玉米在内的，三十种植物的nsLTP进行序列比对， 结果显示nsLTP具有保守的8CM结构。
系统发育分析表明， 杨树的PtLTP同长蒴黄麻的进化关系最近。
根据Swiss-model及Chiemera，构建的PtLTP三级结构模型显示，α-螺旋和卷曲构成LTP空间结构的主要部分，而β-转角则散布在LTP的空间结构中。
先前已有研究，在模式植物拟南芥中，鉴定出了49个nsLTP基因，并对其进行了全基因组分析。
在此选取拟南芥的LTP为对照模型，通过Swiss-ModEL进行三维结构同源建模，发现二者结构存在极小差异。
以杨树幼叶cDNA为模板，使用设计的特异性引物，经PCR扩增和序列测定结果与分析表明，基因的开放阅读框全长357bp。 PtLTP基因编码118个氨基酸，分子量为11.81KD，PI值为9.22。
本试验将PtLTP构建到原核表达载体pGEX-4T-1上，利用IPTG诱导重组蛋白的表达，取未诱导、诱导后两种样品。
经12%十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳分析，发现诱导后的样品在35.0KD区域出现明显的条带， 可能是目的蛋白。
再取诱导破碎后上清和诱导破碎后沉淀样品，经12%SDS-PAGE分析，发现诱导破碎后上清和沉淀中均有目的条带，表明该蛋白以可溶性和包涵体两种形式存在于表达菌中，主要以包涵体形式存在。
紧接着采用GST柱亲和纯化融合蛋白，将收集的蛋白溶液加入镍柱中，在透析溶液中透析过夜，次日进行12%SDS-PAGE分析。
为鉴定分离纯化的蛋白是否为PtLTP蛋白，通过WesternBlot进行检验，印迹显示该融合蛋白与抗His-tag抗体具有特异性识别。
在35~40KD之间的明显的曝光条带，即为PtLTP的纯化蛋白，而25KD处的条带是GST标签所表达的蛋白。
通过荧光定量PCR，检测PtLTP在杨树不同组织中的表达情况， 实验发现该基因的转录水平，具有明显的组织特异性。
具体表现为，PtLTP主要在茎中表达，叶片中表达量次之，而根中表达极低，几乎检测不到。
为了探究PtLTP基因对非生物胁迫的响应，实验采用200μmol/LABA、2mmol/LH2O2、200mmol/LNaCl对杨树进行处理，来模拟不同种类的非生物胁迫。
qRT-PCR结果分析表明在非生物胁迫处理下，PtLTP的表达量显著高于未处理组，说明其在植物抵御非生物胁迫过程中，发挥着重要作用。
当使用ABA处理时，PtLTP的表达量是未处理前的数十倍，PtLTP的高表达提示了， PtLTP在协助ABA整合各种胁迫信号，和调控下游胁迫反应时，发挥着重要作用。
同样的，NaCl处理组有着与ABA处理组相似的变化趋势，而H2O2处理组则是在处理后12h，其相对表达量出现了明显的降低，在24h达到峰值后再次降低。
实验结果讨论
LTPs广泛分布于植物、动物和微生物中，约占高等植物细胞可溶性蛋白的4%。 nsLTP分类为研究人员提供了解nsLTP蛋白的全面信息，并帮助进一步促进nsLTP蛋白的功能分析。
最新研究采用一种新的分类系统，根据8CM模式的半胱氨酸残基聚为9种类型，显著差异是识别了一种新的XI型，排除了VII型锚定的糖基磷脂酰肌醇LTP。
目前nsLTP家族已在拟南芥、水稻、小麦、玉米和其他植物中被鉴定出来。然而，关于杨树的nsLTP家族，目前尚不清楚。
研究挑选PtLTP基因家族中的，一个基因XM_006387137，并对其分子特征和表达模式，进行了研究分析。
PtLTP具有LTP的标准化共同结构特征，如低分子量、保守的半胱氨酸残基、碱性PI等。系统发育树分析表明， 杨树的PtLTP同长蒴黄麻的进化关系最近。
此外，拟南芥、玉米和水稻等单子叶植物的nsLTP，与杨树等双子叶植物的nsLTP，在进化树上有明显的区别。
目前，有关nsLTP的研究已经揭示了，nsLTP具有含4个α–螺旋结构、一个穴状疏水腔和一段曲折延伸的C末端的特征，但具体结构会因为部分氨基酸残基的差异而有所不同。
实验中杨树的PtLTP的三级结构，也验证了这种典型结构。
nsLTPs生物学功能的研究由来已久，早在上世纪九十年代，就已经研究发现， 大麦和玉米叶中分离的nsLTPs，在体外能抑制细菌和真菌病原菌的生长。
为探究杨树的nsLTP是否也有这样的体外功能，下一步实验拟将重组蛋白，应用于测定最小抑菌浓度和最小杀菌浓度，并用于评估纯化PtnsLTP的抗菌活性。
大肠杆菌表达系统，因具有遗传背景清楚，操作简易，成本低廉，蛋白质表达量高又易纯化等优点，而被广泛应用。
将重组pGEX-4T-1-LTP质粒转化至大肠杆菌Arctic-ExpressTM，利用IPTG诱导蛋白表达，经GST柱亲和纯化获取PtLTP的可溶性蛋白，以期对进一步揭示nsLTPs蛋白的生物学功能做出积极贡献。
nsLTP在杨树不同组织中的表达情况，茎部有最高的相对表达量，提示该基因在茎段组织中具有较高的活性和生理重要性，下部茎高于上部茎，叶片又高于根部，而根部几乎不表达。
这种明显的组织特异性， 可能与PtLTP在杨树生长发育过程中所发挥的功能有关。
植物可以感知非生物胁迫的信号和转导，进一步引起相关基因的表达，包括不同种类的转录因子和相关代谢通路基因。
植物对胁迫的响应，并不是简单的线性机制，而是一个涉及多基因、多信号途径和代谢过程的复杂反应机制。
本研究中，PtLTP能够显著地响应ABA、H2O2和NaCl胁迫，表明PtLTP可能在应对植物胁迫方面发挥重要地作用。
qRT-PCR检测表明，ABA处理下PtLTP基因的表达水平相对较高,提示了PtLTP基因可由外源性ABA处理诱导，并参与了ABA依赖的应激反应， PtLTP基因可能被认为是ABA依赖信号通路的调控基因。
先前的研究已经证明，一些LTP基因可以对逆境产生反应，产生抗旱LTP过度表达共振峰。
同时使用2mmol/LH2O2处理杨树来模拟活性氧条件；为了分析盐胁迫下，PtLTP基因可能的转录模式，实验将NaCl处理作为研究植物耐盐性的模型。
结果表明， LTP在调控杨树对这些非生物胁迫条件的响应中，均发挥着潜在的作用， 该研究为今后更深入了解该基因家族奠定了基础，同时也对培育耐逆杨树领域具有积极的意义。