这篇分享的灵感来源是王晓东院士课题组发表的molecular cell文章。看完很有感触，每次参观大牛实验室，墙上大部分都是CNS的文章，有一部分会是molecular cell文章，老点的会是JBC。拿我某师兄一句话，大牛的工作都是冲着cell去的，等做完了，如果意义不大，就投投molecular cell，如果还是不行，JBC算了。这三个杂志有个共同点，在机制上做得非常严谨。
今天分享王院长课题组的2篇文章：2009年的一篇cell，2012年的一篇cell。文章中的科学意义就不细说了，主要看思路，以方便我们自己在研究时参考。
壹
Receptor interacting protein kinase-3 determines cellular necrotic response to TNF-alpha. CELL. 2009.
01
细胞模型及表型（检测指标）
根据文章的描述，在研究细胞凋亡时发现，凋亡诱导分子Smac模拟物可以诱导很多细胞凋亡，且这个凋亡可以被caspase的*制剂抑**z-VAD所抑制，很好的结果。但是，在结肠癌细胞HT-29中，Smac模拟物可以诱导细胞death，但这种death不能被z-VAD所抑制，从而提出在HT-29中Smac模拟物可通过necrosis（坏死）路径促进细胞death（死亡）。（这里， 一个是提出了细胞表型，一个是有了好的细胞模型 ，如果没有HT-29细胞坏死模型，这篇文章就不能继续了。 论细胞模型的重要性。 ）
02
功能分子筛选及验证
有了很好的表型，就开始筛选功能基因了。这篇文章用人的22000个siRNA的化学文库进行了筛选（ 我们现在是用的慢病毒介导的siRNA文库，对细胞的感染效率更高，也更稳定，HCS功能筛选。 ）发现：在坏死诱导建模下（T+S+Z），RIP3干扰后细胞存活增加。（T为TNF-α，代表炎症诱导的坏死；S为Smac模拟物，诱导坏死；Z为z-VAD，抑制凋亡只看坏死。）
RIP3是激酶，那么其功能是否与其激酶活性相关呢。构建了激酶失活的突变体（K50A），发现，激酶活性丢失后，其促坏死的功能丧失。（ 激酶研究，探讨其激酶活性与功能的关系，体现工作严谨的地方 。）
这个实验其实也是 siRNA的回复实验 ，第三组和第四组都是在RIP3-干扰的前提下进行的。第三组是把RIP3不能被干扰的野生型转进去，看对功能的回复，有回复作用。第四组是把不能被干扰的RIP3激酶突变体转进去，发现没有功能回复作用。很完美的数据。
另外一点，这里如果不做第三组的回复实验，就需要展示RIP3两条有效片段的数据，以说明第二组的结果，不是由脱靶造成。高分文章的严谨性。
再有一点，文章中用的是RIP3-shRNA的稳定株，这里要注意，因为RIP3干扰后，细胞活得好好的，可以建干扰稳定株。但也需要尽快用，不然可能会有干扰效果丢失。如果基因干扰后会影响细胞的存活，那么就不建议筛稳定株了。
如果不能建干扰的稳定株，其实还可以做过表达。这篇文章也做了。把激酶突变体构建稳定株，然后看对功能的影响。发现突变体明显要弱于对照细胞株（严谨来说，其实对照应该用野生型的稳定株）。（做实验的时候，如果一个路径不行，再试试另外的路径）
03
动物实验
因为RIP3是激酶，激酶是很好的候选药靶，在功能明确的情况下，值得花经费构建转基因动物。这篇文章构建了RIP3敲除动物。前面研究是在TNF-α刺激情况下造成细胞坏死。因此在敲除动物上诱导了胰腺炎的模型（Cerulein为诱导剂），然后看组织损伤情况。 从基础研究到疾病。
RIP3敲除后，胰腺炎中，组织损伤减少。从临床转化的角度，筛选RIP3激酶*制剂抑**，可能为胰腺炎治疗的先导化合物。
贰
Mixed lineage kinase domain-like protein mediates necrosis signaling downstream of RIP3 kinase. CELL. 2012.
第一篇文章中RIP3是激酶，按照研究的思路机制上应该找其发挥功能的底物是谁。2009年没有找吗？不知道，反正RIP3的底物在2012年又发了一篇cell。（提醒，2009年的文章中不是没有机制，是做了RIP3的上游。）
01
细胞模型及药物筛选
从临床转化的角度，2009年发现了很好的候选药靶，应该可以筛选先导化合物了。采用了前面使用的细胞建模条件，进行了200000个化合物库的筛选，找到了一个化合物可以抑制HT-29在建模条件下的死亡。后续对此化合物进行了修饰后获得了更好的*制剂抑**Necrosulfonamide（NSA）。
一般来说，有了激酶，就筛选激酶的*制剂抑**，但是不同的激酶，活性域结构都差不多， 通过激酶活性筛选出来的*制剂抑**，往往不特异 ，如果上临床，副作用会大。不知道王院士是否是考虑到这一点，从而没有直接筛选激酶的*制剂抑**。
通过细胞活性筛选的*制剂抑**，不一定跟RIP3相关，因此文章中探讨了*制剂抑**与RIP3的关系。证明*制剂抑**与RIP3相关。
02
激酶底物筛选
从研究的角度，有了激酶，需要找到其发挥作用的磷酸化底物。文章中用RIP3进行IP-MS，找到了MLKL。其实，这里只能说明找到了RIP3直接互作的一个蛋白MLKL，MLKL是否受RIP3磷酸化，不知道。其是否有促坏死的功能，也不知道。
03
底物功能
对筛选到的互作蛋白MLKL进行功能探讨。发现，MLKL干扰后，细胞活得多了。（ 机制研究，功能相关性机制 。不清楚的，听场季博的讲座。）
注意，下面这个功能实验，也做了功能回复实验。以证明干扰靶点没有脱靶。
04
药物与靶点关系验证
把NSA偶联生物素，然后去拉蛋白。这里注意，NSA偶联生物素后需要检测是否活性还在。 活性还在的情况下再去拉蛋白 。结果显示，拉下来的蛋白中有MLKL。
且发现NSA与MLKL的结合是共价结合。把MLKL表达出来后，跟Biotin-NSA孵育，然后电泳，发现在MLKL条带处，能够检测到biotin。（*制剂抑**与靶点共价结合，对于临床转化来说，由于其与靶点结合后就不分开了，可能副作用会大。）
05
激酶与底物磷酸化关系验证
前面用RIP3拉到MLKL，只是证明有直接互作关系，不能证明MLKL是RIP3的底物。因此这一步就检测RIP3对MLKL的磷酸化，发现，在体外磷酸化实验中，RIP3可以磷酸化MLKL。到这里，才证明MLKL是RIP3的底物。
并通过质谱鉴定到T357及S358是RIP3磷酸化MLKL的位点。
从研究的步骤来说，如何找到RIP3的底物，并拿到磷酸化位点呢。建议步骤是，a、激酶进行IP-MS，找互作蛋白，listA。2、激酶干预后进行磷酸化蛋白组检测，找磷酸化改变的蛋白，listB。ListA与listB的交集中去验证。交集的蛋白，有激酶互作，通过激酶干预后磷酸化也有改变。同时，磷酸化蛋白组的结果中也告诉我们改变的磷酸化位点是什么。一举多得。（ 研究激酶的老师，一定要参考，比一步一步做要靠谱。 ）
06
底物磷酸化位点功能验证
研究激酶与底物，底物磷酸化位点找到后，一定要证明这个位点的磷酸化与功能相关。因此就做了这两个位点的组成失活型突变体（T357A、S358A），发现组成失活型突变体不能促进细胞的坏死。
磷酸化位点，除了做组成失活型外，还可以做组成激活型。文章中也做了组成激活型（T357E、S358D），发现组成激活型与野生型功能一致。
文章中还做了很多个性化的数据，有兴趣的老师可以看看。
总结
激酶与底物的关系探讨工作，可以做得很细，很严谨。是高档次文章喜欢的内容。同时，激酶容易筛选*制剂抑**，是很好的候选药靶，临床转化喜欢的内容。
1、研究中，组学做完后，看组学中改变的激酶有哪些。
2、这些改变的激酶优先做功能探讨。可以跟第一篇文章学，采用HCS的方法找有功能的激酶。
3、找到有功能的激酶后，探讨其功能与其激酶活性是否相关。（活性位点进行突变）
4、验证出其激酶活性与功能相关后，找底物。（激酶IP-MS找互作蛋白，激酶干预做磷酸化蛋白组，两者取交集后验证。）（激酶做IP-MS，由于激酶结合底物后很快磷酸化并解离，这个IP-MS的数据不一定理想。而激酶失活突变体做IP-MS，结合的底物不能磷酸化，不能很快解离，从而容易检测到。但有些激酶需要自身磷酸化后才结合底物，这种情况下做失活突变体的IP-MS，还是拉不到底物。此步骤遇到问题的老师，找季博。）
5、底物进行功能验证，以证明底物功能与激酶一致。（交集比较多时，可以将这些底物拿功能HCS进行筛选）
6、拿到功能一致的底物后，进行激酶与底物进行直接互作验证。
7、从磷酸化蛋白组中找底物磷酸化位点，底物磷酸化位点进行功能验证。以证明底物发挥功能需要此磷酸化位点。（组成失活型突变为A，组成激活型突变为D或E）
8、根据研究的疾病及功能表型，补充其他细胞学实验。如果数据好，尝试构建转基因动物。
以上是激酶研究的思路，比较粗，每个课题都需要根据实际情况来进行调整。供大家参考。