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编辑|冷紫葉

a-L一岩藻糖昔酶(a-L-fucosidase(EC3.2.l.S1);a-1,3/4-L-fucosidase<EC3.2.1.111)；a-1,2-L-fucosidase(EC3.2.1.63))是一类在生物体中广泛存在的外切糖普酶，能够将a-L-岩藻糖基从糖链的非还原端水解下来。

根据a-L-岩藻糖昔酶的作用机制以及序列的同源性，其被划分为两个家族:GH29家族(构型保持酶)和GH9S家族(构型翻转酶)。在人类母乳寡糖(HMOs)中，岩藻糖基化的寡糖占80%以上，这些岩藻糖基化的寡糖对于调节肠道微生物的菌群生态具有重要的作用。

Fuc-G1cNAc在人类母乳寡糖、Lewis血型抗原以及一些细胞表面的糖缀合物受体上广泛存在，作为益生元，已经被广泛地应用于婴幼儿配方奶粉、保健品以及制药领域中。

本章通过对CAZy数据库(http://www.cazy.org)和脆弱拟杆菌基因组分析发现肠道微生物脆弱拟杆菌(B.户agilis)的基因组中存在13个a-L一岩藻糖昔酶，其中9个属于GH29家族，4个属于GH9S家族。

通过进化树分析发现9个GH29家族的a-L-岩藻糖普酶中有S个属于GH29A家族，4个属于GH29B家族。本章将GH29A家族的酶进行了异源表达、纯化以及转糖基活性的筛选，发现a-L-岩藻糖昔酶BF3242能够以以pNP-a-Fuc为供体。

并对产物结构进行了核磁鉴定，发现a-L一岩藻糖昔酶BF3242能够合成Fuc-a-1,3-G1cNAc和Fuc-a-1,6-G1cNAc两个产物，产率分别为ZS.S%和S3.S%总产率为79%。

菌株和质粒

大肠杆菌((Escherichiacoli)的DHSa菌种、大肠杆菌((Escherichiacoli)的BL21(DE3)菌种以及pGEX-4T1质粒均为本研究室保存。菌种脆弱拟杆菌(B.fragidisNCTC9343)为日本京都大学KenjiYamamoto赠送。

培养基以及培养条件

LB液体培养基(1000mL,pH7.0):取lOg蛋白陈、Sg酵母膏、7gNaCI定容至1000mL，调pH至7.0。在LB液体培养基中加入1.5%琼脂粉即得LB固体培养基。培养E.coli重组菌时培养基中加入总浓度为SO}g/mL的氨节。E.coli培养条件为370C,200rpm常规培养，诱导条件为200C,120rpm。

a-L.岩藻箱普醉的序列分析

进化树的构建首先使用ClustalX进行氨基酸序列比对，删除中间的冗余序列，然后利用MEGA5进行进化树的构建。蛋白质氨基酸多序列比对是使用ClustalX软件完成的，岩藻糖昔酶的结构域分析是使用NCBI结构域分析网站完成的。

脆弱拟杆菌基因组的提取

使用天根的细菌基因组提取试剂盒进行脆弱拟杆菌基因组的提取。具体操作方法步骤依据使用说明书。

大肠杆菌质粒提取

使用上海生工的质粒抽提试剂盒进行大肠杆菌(DHSa)重组质粒的提取。具体操作方法步骤依据使用说明书。

琼脂摘凝胶电泳

使用水平式电泳槽，琼脂糖凝胶的配制浓度为0.$%<w/v)并且在凝胶液中加入核酸染料GeIRed用以显色，凝胶电泳条件为恒压SV/cm。电泳后在紫外下观察电泳条带。

目的基因的扩增扩增目的基因的引物是通过Primer软件设计的，引物由上海生工公司合成。引物的核昔酸序列表如下:PCR的反应体系为:10ng的基因组作为模版，1.5mM的Mgt+}2001.}1Vi的dNTP}0.4}M的引物以及2.5U的FastPfuFlyDNA聚合酶。2.1.5.5贡组质粒的构建

利用PCR产物纯化试剂盒进行纯化，利用Nanodrop2000检测DNA的浓度，然后利用T4DNA连接酶进行连接，转入大肠杆菌中挑取单克隆转化子。

将GST填料装柱，先用BindingBuffer平衡柱子，然后上样，继续用结合缓冲液冲洗柱子，待基线平稳以后，用洗脱缓冲液冲洗柱子，收集洗脱的目的蛋白，用超滤管对洗脱液进行超滤浓缩。整个操作过程利用AKTApurifier10蛋白纯化系统进行蛋白的纯化。结合缓冲液:PBS，pH7.3(140mMNaCI}2.7mMKCI}10mMNazHPOa.1.8mMKH2POa}pH7.3)。

下层分离胶的聚丙烯酞胺的浓度为10%。蛋白Maker为TheretoScientific的编号为26616的预染蛋白Marker。使用NanoDrop2000CThereto)在280net处测定光吸收。

岩藻栩昔蔺水解活性的侧定

取适当稀释的酶液20泌，加入60匹的2mM的户NP-a-Fuc溶液(溶剂体系为含有20%DMSO的SOmMpH7.0的磷酸盐缓冲液)，在370C下反应10~，然后加入120泌的1M的碳酸钠溶液终止反应。

a-L-岩藻箱昔阵水解底物特异性

参照2.1.7_1的测定方法，对12种硝基苯糖昔CpNF-a/p-L-fucopyranoside;pNP-a/(3-D-galactopyranoside,pNP-a/}i-D-glucapyranoside,PNP_a/p-D-mannopyranoside,pNP-N-acetyl-a/p-D-galactosaminide和pNP-N-acetyi-哪-D-glucosaminide)的水解活性进行测定。

然后本章还使用岩藻糖测定试剂盒，对异源表达的a-L-岩藻糖昔酶对AntigenHdisaccharide,Lea和Lextrisaccharides，Fuc-a-1,3-G1cNAc}Fuc-a-1,4-G1cNAc,Fue-a-1,6-G1cNAc等天然寡糖进行水解，以了解不同酶对不同键型的水解偏好性，测定具体方法参照岩藻糖测定试剂盒说明书。

最适温度及温度稼定性

以pNP-a-Fuc为底物，在200C到“0C的温度范围内，将酶保温1h后，按方法测定酶活，可测得酶的稳定性;以pNP-a-Fuc为底物，在200C到650C的温度范围内，按照方法测定酶活，可测得酶的最适反应温度。

最适pH及PH德定性

广泛缓冲液的配制(L-i):取6.008g的柠檬酸、3.893g的磷酸二氢钾、1.769g的硼酸以及5.266g的巴比妥溶解在900mL的水中，用NaOH溶液调节至不同pH，最后定容至1000mL。

将pNP-a-Fuc溶解于100mM,pH7.0的磷酸钠缓冲液中，将酶放于不同的pH的广泛缓冲液中40C,12h后，按照方法测定酶活，就可以测得酶的pH稳定性;将pNP-a-Fuc溶解于30mM不同的pH的广泛缓冲液中，按照方法侧定酶活，就可以得到酶的最适反应pH。金属离子对蔺活性的影晌在反应体系中加入1mM的金属离子以及赘合剂。

GH29A的a-L-岩藻精昔阵以摘为受体转精基活性的筛选对4个成功异源表达的GH29A家族的a-L一岩藻糖昔酶(BF0028,BF0810,BF3242和BF3591)以葡萄糖、乙酞氨基葡萄糖(G1cNAc)、果糖、半乳糖、纤维二糖、麦芽糖或者乳糖为受体进行转糖基活性的筛选。以20mM的pNP-a-Fuc为供体，以200mM的各种糖为受体，进行转糖基反应，分别于0.5h和1h取样，然后进行TLC检测分析。

BF3242的转箱基条件的优化

为了提高BF3242的转糖基产率，本章对反应条件进行了一系列优化，包括底物的浓度、pH值、温度以及反应时间。转糖基产物产率为所生成的产物浓度与供体初始浓度的比值。在转糖基优化过程中，所使用的酶的浓度为0.05U/mL。

受体浓度的优化:以20mM的户NP-a-Fuc为供体，分别以100,200,300,400,500和600mM的G1cNAc为受体，在370C下，pH7.0的缓冲液中反应1h。

在最佳的受体浓度(500mM)的条件下，分别以10,20,30,40,50和60mM的供体浓度，在370C下，pH7.0的缓冲液中反应1h。

在最佳的供体浓度(20mM)和受体浓度(500mM)的条件下，在不同的pH(4.0,4.5,5.5,6.0,6.5,7.0,7.5,8.0,8.5,9.0,9.5,10.0,10.5和11.0)条件下，在370C中反应1ho在最佳的供体浓度(20mM)、受体浓度(500mM)和pH值(pH7.5)的条件下，在不同的温度(200C,250C,300C,370C,400C,450C,500C,550C,600C和650C)条件下，反应1ho在最佳的供体浓度(20mM)、受体浓度(500mM)、pH值(pH7.5和反应温度(370C)的条件下，在3h内间隔8个时间取样。

产物的检侧

取1泌的反应液在TLC薄层层析板点样后，在展层剂(正丁醇二乙醇:水=15:1:1)中展层三次，雾喷显色剂(苯胺二苯胺磷酸)，于8s0C烘烤30min糖斑点显色。

苯胺二苯胺磷酸显色剂配制:取8g的二苯胺溶解于400mL的*酮丙**中搅拌溶解，然后加入8mL的苯胺溶液，搅拌，最后加入40mL的85%的磷酸溶液，搅拌，得到澄清透明液体，避光保存。

将反应混合物在1000C的沸水中煮沸10min，然后15000rpm离心1h}取上清进行HPLC分析。上样量为10匹。分析柱为WatersNHS<4.6~“250mm)，91%乙腊，9%三蒸水，流速1mL/min，柱温350C，在210nm下进行检测。

质谱及核磁共振波谱的结构鉴定

转糖基产物经过HPLC纯化后，利用ShimadzuLCMS-II=TOF质谱仪在正负离子源模式下检测。产物的结构确定是利用AgilentDD2600MHz核磁在25℃下完成的。该核磁的‘H谱分辨率 为so0MHz，13c谱分辨率为150MHzo产物溶解在D20中，利用该核 磁分别采集H,13C,COSY.HMBC及HSQC数据，然后对核磁图谱进行解析。

结果

根据CAZy数据库分析可得，在脆弱拟杆菌的基因组中预测的有多达I42个糖昔酶，这些糖营酶成为挖掘新的糖昔酶的重要来源，其中有13个a-L一岩藻糖昔酶基因，其中有9个a-L-岩藻糖昔酶属于GH29家族(BF0028,BF0664,BF0804,BF0810,BF179s,BF3083,BF3201、BF3242和BF3591)，4个“-L-岩藻糖昔酶属于GH95家族(BF0474.BF0570,BF0855和BF4255)。

这13个，卜岩藻糖昔酶经过预测分析都没有跨膜域。信号肤预测分析结果显示，除了BF0570和BF0664预测没有信号肤外，剩余的11个酶都有信号肤。

所有酶分子量都在4793kDa之间，其中GH29家族的a-L一岩藻糖昔酶的分子质量较小，在4769kDa之间，GH95家族的a一岩藻糖昔酶的分子质量较大，在8698kDa其中a-L一岩藻糖营酶共分为两个家族:GH95家族和GH29家族。GH95家族为构型翻转酶，专一性的水解a-1,2的岩藻糖普键，并且不能水解人工底物pNP-a-FucoGH29家族的a-L一岩藻糖昔酶为构型保持酶，又可以进一步被分为GH29A和GH29B两个亚家族。

GH29A亚家族的a-L一岩藻糖普酶水解的底物键型很广泛，能够水解a-1,2,a-1,3,a-1,4或者a-1,6的岩藻糖昔键，并且可以水解人工底物pNP-a-Fuc，因此具有利用pNP-a-Fuc当作供体进行转糖基反应，合成转糖基产物的潜力。

而GH29B亚家族的a-L一岩藻糖昔酶水解的岩藻糖普键键型不如GH29A亚家族宽泛，只能水解。-1,3,a-1,4的岩藻糖普键，并且不能够水解人工底物pNP-a-Fuc，因此也不能够以pNP-a-Fuc作为供体进行转糖基反应。

为了进一步区分两个亚家族，本章对来源于脆弱拟杆菌的9个GH29家族的a-L一岩藻糖普酶。通过进化树分析，发现了5个a-L一岩藻糖昔酶(BF0028,BF0810,BF1796.BF3242和BF3591)属于GH29A家族，剩余的4个。-L一岩藻糖昔酶CBF0664.8F0804.BF3083和BF3201)属于GH29B家族。

同时，对GH29A家族和GH29B家族进行了多序列比对(图2.2)，通过多序列比对，发现GH29A家族的亲核体位点十分保守，均为天冬氨酸残基(D)，但是酸碱催化位点则不保守，来源于人(HomoSapiens)的a-L一岩藻糖昔酶CFucAl)的酸碱催化位点为294位的谷氨酸(E)，来源于海栖热袍菌(Thermotogamaritima)的a-L一岩藻糖昔酶(TM0306)的酸碱催化位点为266位的谷氨酸(E)。

相反，GH29B亚家族，L-岩藻糖昔酶的亲核体位点和酸碱催化位点都十分保守，分别为天冬氨酸残基（D）和谷氨酸残基伍)。

Met263位点的饱和突变

结果显示BF3242 L244H-M263T的总转糖基产率可达到85%，较BF3242 WT的74%有显著提高，突变酶BF3242L244H-M263R、BF3242 L244H-M263K、BF3242 L244H-M263W、BF3242L244H-M263N、BF3242 L244H-M263D、BF3242 L244H-M263P、BF3242L244H-M263F. BF3242 L244H-M263Y和BF3242 L244H-M263I的转糖基产率在65%至75%的范围。

与BF3242 WT相比无明显变化;突变酶BF3242L244H-M263Q. BF3242 L244H-M263E和BF3242 L244H-M263H的转糖基产率均低于65%，其中，BF3242 L244H-M263E和BF3242 L244H-M263H的产率为47%和46%，显著低于BF3242 WT的产率。

最好的突变酶BF3242 L244H-M263T的总的转糖基产率为85%，同时对Fuc-a-1,3-G1cNAc的区域选择性为也很严格(97% )。

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