科研科普

细胞计数这项基本功，你真的掌握了吗？

在细胞培养工作中，常需要了解细胞生活状态和鉴别细胞死活，确定细胞接种浓度和数量以及了解细胞存活率和增殖度，如用酶消化制备的细胞悬液中细胞活力的鉴别，冻存细胞复苏后的活力检测等。因此，细胞计数是一项基本功，尤其是当仪器的结果出现异常时，手工显微镜检查就显得尤为重要。

细胞计数一般用血细胞计数板，按白细胞计数方法进行计数。

壹

实验准备

在进行细胞计数之前，我们先来了解一下计数板的基本构造。

以汤麦式为例，一个计数板中存在三种类型的方格：大方格（红框）、中方格（绿框）、小方格（蓝框），对于血细胞而言，四角的大方格用于计数白细胞，而中央的大方格用于计数红细胞。其中，每个大方格的边长为1mm，计数室深度为0.1mm，因此， 每个大方格的容积为0.1mm3（μl） 。

贰

实验步骤

01

制备细胞悬液

a. 对于贴壁生长的细胞，我们需要首先使用胰酶消化细胞为单细胞悬液；悬浮细胞则无需消化，稀释到合适倍数即可。

b. 台盼兰 染色（可选）：如果需要计算细胞的活率，则需要将细胞悬液和0.4%台盼兰（也可以用 伊红 ）体积混合（1:1），室温孵育3-5分钟（悬浮细胞染色时间可视情况适当延长）， 只有死细胞被染色 。

02

血细胞计数板加样

使用吸管或移液器将细胞悬液或细胞/台盼兰混合液滴加到计数池的边缘，此时液滴将在 虹吸 的作用下进入盖玻片下方的计数池，此即为 充池 ，将计数板 静置 几分钟使细胞扩散、沉降。

03

细胞计数

在低倍镜（10×10倍）下进行计数，移动计数板调整视野， 计数落在白细胞计数区域（四角的大方格）的细胞 。

计数原则：

①只计数完整的 活细胞 ，折光性强而不着色者为活细胞，染上蓝色者为死细胞；

②若聚成 一团 的细胞则 按一个 细胞进行计数；

③在 一个 大方格中，如果有细胞位于线上，计数原则为： “计上不计下，计左不计右” ；

④两次重复计数误差不应超过5%。

04

换算浓度

每个大方格的容积为：

1mm2×0.1mm=0.1mm3=10-4cm3=10-4mL

①在常规没有使用 台盼兰 染色时，可以用下面计算公式：

细胞悬液细胞数/mL=(四个大格细胞总数/4)×104×稀释倍数

（稀释倍数：制备细胞悬液时的稀释倍数）

②如果使用 台盼兰 染色，还需要计算活细胞的百分率：

活细胞百分率(%)=台盼兰拒染细胞数/总细胞数×100%

此时活细胞数的计算公式为：

细胞悬液活细胞数/mL=(四个大格细胞总数/4)×活细胞比率×104×稀释倍数×2

（稀释倍数为制备细胞悬液时的稀释倍数，×2是指细胞悬液与台盼蓝染液1:1稀释）

叁

注意事项

1、滴加细胞悬液时要干净利落， 加量要适当 （大约9 μL），过多易使盖片漂移或淹过盖片，过少易出现气泡，充池不理想时应重做。

2、镜下计数时，若方格中细胞 分布明显不均 匀，说明细胞悬液混合不均匀，需重新将细胞悬液进行混合，再重新计数。

3、计数板计数时， 最适浓度为(5～10)×105细胞/mL ，此范围外计数误差偏大，高浓度细胞悬液，可取出部分作稀释或连续稀释后计数，如果浓度很低则要进行离心再悬浮于少量培养液中。

4、经常使用同一细胞在相同条件下工作时，可略去某些环节，如染色检查等。

5、使用计数板法计数细胞 有一定误差 ，用作测定细胞生长曲线时，每一样品应重复计算4次，取均值，较为可靠，最好使用电子细胞计数仪器。

参考资料：

https://www.biomart.cn/experiment/1161.htm

https://baijiahao.baidu.com/s?id=1720003226176466845&wfr=spider&for=pc

http://www.bioon.com.cn/news/showarticle.asp?newsid=94526

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