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引言
在本次实验中，针对CLARITY技术对植物组织的适应性进行了研究与改进，并添加了酶降解以提高光学清晰度和促进抗体探针穿透。
通过植物酶辅助(PEA)-CLARITY技术可以对水稻、*草烟**和拟南芥叶片中的染色、表达的荧光蛋白和igg抗体进行深度光学可视化。
酶处理使抗体能够渗透到整个组织而不需要任何材料的切片，从而促进完整组织在3D中的蛋白质定位，同时保留细胞结构。
3D免疫染色法也适用于减数分裂特异性蛋白的细胞内定位，如位于细胞质中的生殖细胞特异性ARGONAUTE MEL1和减数分裂染色体上的粗线标记ZEP1。
接下来，笔者将就单细胞和细胞内分辨的3D多重免疫染色方法在全面的器官水平的分子机制和细胞连接层面的应用与测试进行阐明。
一、3D成像研究技术发展及在植物学的应用方法
数十年来，利用组织学染色、免疫组织化学或原位杂交等技术对植物组织进行固定和包埋进行分子研究一直是细胞生物学研究的基础。
这些技术在实际应用于3D组织分析时，由于需要对组织进行切片，对每个切片进行成像，然后将图像重新组装成感兴趣的结构的3D表示，因此受到严重限制。
在这里，我们提出了从二维平面到三维平面的基本转变，同时保留了感兴趣的分子结构，而不需要切割植物组织。
使用共聚焦显微镜对植物进行三维成像仅限于已经半透明的组织类型，如根尖或分生组织，但在组织深处的细胞中，分辨率下降明显。
其他特定于植物的成像技术，包括改良的伪希夫碘化丙啶(mPS-PI)染色法，确实允许深度光学穿透，但其中的清除步骤也会去除需要被观测的蛋白质和核酸。
将诸如CLARITY等技术应用于植物材料的主要障碍之一是细胞壁，细胞壁的主要成分是纤维素、半纤维素、木质素和果胶等，它们组合的细胞壁只对小于60kda的分子具有渗透性。
这产生了一个显著的通透性屏障，因为在免疫组织化学中使用的常见IgG抗体的大小约为150kda，因此不能穿透细胞壁。
PEA-CLARITY利用细胞壁降解酶来增加细胞壁的通透性，同时利用淀粉水解酶来减少淀粉粒的光学干扰，从而克服了这一限制。
二、实验过程及方法
2.1 组织固定和清除
在光照开始前30分钟，用7毫米的叶片打孔机切除烟叶，以限制淀粉的积累。
然后立即将圆盘放入CLARITY水凝胶溶液中(见补充6)并保存在冰上。拟南芥的全叶也在光照开始前30分钟采收，并像上面一样固定。所有组织均置于- 100 kPa的真空中1小时，同时置于冰上以促进水凝胶的浸润。
样品在4℃水凝胶溶液中保存过夜。每个圆盘/叶片被转移到一个单独的管，充满水凝胶， 注意去除气泡，然后密封，并在37℃下聚合过夜。
聚合后去除多余的水凝胶，并将样本转移到用硼酸缓冲的50 ml 4% SDS澄清液中(见补充6)。在37℃温和搅拌4 ~ 6周(或直至澄清)，每日更换澄清液，被动清除样本。
清除后，对样本进行染色，或将含有内源性荧光的样本安装起来进行成像。
2.2 染色和酶降解
用0.1%碘化丙啶水溶液和/或(取决于酶混合物)0.05%氟钙白水溶液在黑暗中染色20分钟，然后用0.001% NaN3在pH 7.4的PBS中洗涤。
首先用0.001% NaN3在pH 7.4的PBS中洗涤至少3次以去除所有SDS (SDS抑制酶活性)来实现细胞壁的酶降解。去除所有SDS后，将样品小心地置于含有纤维素酶、木聚糖酶、阿糖呋喃苷酶、果胶裂合酶和α-淀粉酶的酶混合物中，并在- 100 kPa下进行3 × 5分钟的真空浸润。
在37℃在黑暗中非常温和地搅拌下孵育样品，每天重复负压渗透5 ~ 7 d, 3 d后将样本转入新鲜酶液中。
这里需要特别注意，务必小心地从酶混合物中取出样品，然后用0.001%的NaN3在pH 7.4的PBS中洗涤3次。
2.3 RuBisCO的免疫荧光定位与成像
将组织置于抗rubisco14 1:100稀释于PBST pH 7.4的溶液中，在- 100 kPa下间断真空浸润3 × 5 min，每日3次，孵育5天。然后样品在50 ml PBST pH 7.4中洗涤24小时，三次溶液变化和非常温和的搅拌。
洗涤后，将组织转入抗兔Cy5二抗(1:200,PBST pH 7.4)中，同前间断真空浸润孵育5天，后将样品在0.001% NaN3中在pH 7.4的PBS中洗涤24小时，并安装用于成像。
将样品置于pH值为7.4的PBS中，使用Leica SP8 CLSM，使用Leica 20 × na = 0.5水浸物镜、白光激光和混合探测器在分辨率为1024 × 1024像素的情况下进行成像。
查看完整的显微镜设置(见元数据补充)。本文中显示的所有图像都是来自徕卡SP8的原始图像。在Leica Applications Suite-Fluorescence (lasaf)软件中进行三维重建。
三、讨论与分析
细胞壁降解酶已被用于在拟南芥顶端分生组织中实现3D免疫荧光，但由于酶的苛刻降解，组织失去了结构完整性。
另一种对比方法是使用尿素作为清除率，结合酶处理，生成植物组织的三维结构图像，以同时定位细胞核和细胞壁。他们还保留了瞬时表达的mTalin-citrine的荧光，显示了在清除的烟叶深处完整的肌动蛋白微丝。
然而，该方案使用切片的豌豆根瘤来帮助抗体穿透，并且只能使用短时间的酶处理来避免对组织的结构损伤。
亚细胞和单细胞分辨率的三维(3D)器官成像对于全面理解分子机制至关重要，因为许多生物的发育机制涉及精确的时空调控。
多细胞真核生物的生殖器官由体细胞和生殖细胞组成，作为核心沉默机制的三个ARGONAUTE (AGO)蛋白在体细胞和胚芽之间的位点特异性调控至关重要。
除了这些空间控制，沉默或转录因子还介导植物生殖器官中从体细胞到胚芽的细胞连接，因此，全器官免疫组织化学技术的发展也有助于阐明在动物和植物中，在单细胞水平上区分的体细胞和胚芽之间的发育分子机制和细胞连接。
花药是植物雄性生殖器官的主要组成部分，由生殖细胞(也称为花粉)和花药壁组成，花药壁围绕着生殖细胞，由三到四层外体细胞组成。
形态学显像结合组织化学染色有助于观察组织结构，区分各个单细胞，然而对花药等结构的形态分析需要许多步骤，包括组织固定、树脂包埋、切片和染色。
我们最近的组织化学成像研究使光片显微镜能够可视化整个水稻花药的三维结构，该方法还可用于揭示叶片叶肉细胞的内部结构，表明形态学分析适用于检测突变体的发育缺陷。
用碘化丙啶(PI，红核)和荧光钙白(CW，绿细胞壁)染色，以评估DNA和细胞结构的保留。使用CLSM对整个完整的*草烟**叶盘成像，并将z-栈组装成一个原始的、未处理的三维切片重建。
光学穿透整个叶片厚度得以实现，维管状、表皮状、栅栏状和海绵状的叶肉细胞结构，细胞核均固定在细胞质内。
甚至长体表毛突起仍然垂直于整个叶盘的表皮表层(见补充1关于基底层体表毛的方向;完整体表绒毛未成像)，PI染色显示出细胞核内DNA的保留完好。
而另一方面，来自拟南芥的成熟叶片稳定转化过程中，将GFP定位于内质网或CFP定位于过氧化物酶体，以评估内源性荧光蛋白的保留。
在被清除的拟南芥叶片中，我们观察到强烈的ER-GFP和Px-CFP，包括深度约80 μm的叶片内韧皮部。
成熟的*草烟**叶来自稳定转化的*草烟**细胞系Sv-40, GFP定位于核13，使用PEA-CLARITY处理，与细胞壁消化酶孵育，用*草烟**RuBisCO多克隆抗体14进行免疫标记，以证明蛋白质的保留和IgG抗体的组织穿透3D全组织免疫定位。、在栅栏状和海绵状叶肉细胞的完整叶绿体中都观察到RuBisCO的免疫标记。
从*草烟**叶片组织中也观察到强的、定位于细胞核的GFP荧光，表明GFP荧光通过酶处理保持在正确的亚细胞室中。
*草烟**芽孢杆菌阴性对照，以及草狗尾草(Setaria viridis) PEA-CLARITY处理后的进一步免疫标记例子如下图所示。
以上观测到的现象，证实了PEA-CLARITY是一种强大的技术，常常应用于分子探针等场景中，包括染色剂，内源性荧光蛋白和免疫组织化学，使细胞成分在整个未切片的组织中定位。
虽然利用RNA探针进行原位杂交在这里还没有得到证实，但从理论上讲是可行的，此法在动物组织的3D成像中已经被论证了可操作性。
作为概念验证，本研究使用了三种模式物种——水稻（Oryza sativa L.），拟南芥(a . thaliana)和*草烟**芽孢杆菌(N. tabacum)的成熟雄蕊及叶片，考虑到PEA-CLARITY技术将适用于广泛的物种，在后续的补充实验中可能需要针对个别物种和组织类型进行调整。
初步试验将该方案应用于一系列物种和组织器官，实验过程中发现，部分较老的或含糖量高的组织通常在清除过程中呈现棕色。
该方法处理的植物组织也存在一些缺点，包括:一些组织清除不完全，经酶处理后组织脆弱，以及在长时间被动清除(~6个月或更长时间)后GFP荧光消退。
我们发现不纯的酶制剂可能含有可降解某些细胞内容物的核酸酶和蛋白酶，并注意到在酶消化不完全后，通过细胞壁输注抗体仍然困难。
与非真空处理的样品相比，在酶和抗体孵育期间应用间歇真空大大提高了穿透性，通过在暗光期结束时收获降低淀粉水平，许多组织的清除率得到改善。
阻碍较大荧光团进一步清除和渗透的组织包括含有蜡和酚类的组织，例如厚表皮表面和木质化组织。
虽然目前还没有商业上可用的木质素酶和角质酶，但未来可能会开发这些酶，并且正在探索化学疗法，以期改善蜡质和酚类组织的清除效率。
优化组织特异性细胞壁降解酶组可能进一步提高抗体穿透和光学清晰度。
总结
本文所述的PEA-CLARITY技术结合了水凝胶固定、组织清除和酶降解，从而可以对表达的荧光蛋白(包括GFP和CFP)进行可视化，同时可以在完整的组织中使用常见的IgG抗体进行免疫荧光标记，而不会失去结构的完整性。
CLARITY技术还允许光学深入到具有明确的筛元/伴生细胞(SE/CC)核的维管束中，而不需要切片或表皮剥除。
PEA-CLARITY中提出的酶降解步骤可能对哺乳动物系统也有益，有助于困难动物组织的清除和荧光团渗透。
同样地，在动物组织中，光片显微镜的应用可以减少图像采集时间，减少组织漂白，并在生成三维重建时提高z平面分辨率。
CLARITY清晰度和成像方案对植物组织的适应为完整植物样本的3D分子检测铺平了道路，PEA-CLARITY的实现将有助于更全面地理解植物器官的结构和功能之间的关系以及空间调控的分子过程。
参考文献
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刘鑫，《一种用于细胞核成像的新型双光子荧光探针》
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郭光沁，《绿色荧光蛋白在活体细胞分子生物学研究中的应用》
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