文丨初八没烦恼
编辑丨初八没烦恼
WRKY转录因子 是高等植物中最大的转录因子家族之一，在植物的生长发育和衰老、非生物和生物胁迫等过程中发挥着重要的作用。
疣粒野生稻是栽培稻的近缘野生种，具有耐荫、耐旱和高抗白叶枯病等特性，是改良栽培稻的重要基因库。
本次在疣粒野生稻基因组中鉴定了 94个编码WRKY转录因子的基因 ，分布在12条染色体上，1号染色体上最多，5号染色体次之，最少的是10号染色体。
与已报道的稻属11个基因组相比，在疣粒野生稻中没有鉴定到WRKY40和WRKY60的同源基因。
之前研究结果为稻属AA染色体组种所特有的Ib亚组，在GG染色体组的疣粒野生稻基因组中也鉴定到同源基因OgWRKY61。
WRKY转录因子结构域
WRKY转录因子是高等植物中最大的转录因子家族之一，在植物的生长发育和 衰老、非生物和生物胁迫 等过程中发挥着重要的作用。
自1994年，第一个WRKY转录因子成员SPF1从甘薯中克隆，此后相继在拟南芥、水稻、大豆等多个植物中被鉴定和研究。
在过表达 TaWRKY19基因 的拟南芥中，DREB2A、RD29A、RD29B和Cor6.6的表达上调，植株对盐、干旱和冷胁迫的耐受性增强。
甘蔗ScWRKY5基因受盐胁迫和干旱胁迫诱导表达。辣椒的WRKY蛋白CaWRKY27，可通过调节*草烟**植株中的SA、JA和ET信号通路，增强对青枯雷尔氏菌感染的抗性。
在拟南芥中过表达水稻的OsWRKY45基因，提高了植株对盐胁迫和干旱胁迫的耐受性。
表达OsWRKY13的水稻植株 增强了对白叶枯病和稻瘟病的抗性 ，SA合成和应答相关基因表达激活，JA合成和应答相关基因表达被抑制。
也表明OsWRKY13基因通过直接或间接调控SA和JA上下游基因的表达，参与水稻的抗病性。OsWRKY30正调控水稻对白叶枯病、纹枯病、稻瘟病和叶条纹病的抗性。
而OsWRKY71基因的水稻植株增强了对水稻白叶枯病菌的抗性，经过专家研究表明，OsWRKY31是MPK信号通路中与 稻瘟病抗性 相关的一个关键组份。
此外，ANIP1-OsWRKY62模块可以调节水稻抗稻瘟病菌的基础防御和Pi9介导的免疫。
WRKY转录因子含有1-2个WRKY结构域 ，为DNA结合域，由约60个氨基酸残基组成，N端包含典型的WRKYGQK七肽序列。
为WRKYGEK、WRKYGKK、WRKYGRK、WRICGQK、WRMCGQK、WKKYGQK、WIKYGQK、WKRYGQK、WSKYEQK和WRKYSEK变异序列，C端包含锌指结构C2H2/C2HC。
WRKY转录因子可通过 WRKY结构域与靶基因启动子区 的顺式作用元件Wbox(TTGACC/T)特异性结合，以此激活或抑制转录，进而调控下游基因的表达。
根据WRKY转录因子所含WRKY结构域数量和锌指结构的特征，将WRKY转录调控因子分为Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ和Ⅳ4个组。
Ⅰ组WRKY蛋白含有2个WRKY结构域，进一步根据所含锌指结构类型由分为Ia和Ib亚组，分别含 C2H2锌指结构和C2HC锌指结构 。
Ⅱ组WRKY蛋白含有1个WRKY结构域和一个C2H2锌指结构，根据其锌指结构特征分为IIa，IIb，IIc，IId和IIe五个亚组。
Ⅲ组WRKY蛋白含有1个WRKY结构域和一个C2HC锌指结构；Ⅳ组 WRKY蛋白锌指基序 部分缺失或完全缺失，但含有1个WRKYGQK基序。
WRKY转录因子的进化分析对理解植物生物多样性的整体机制，以及WRKY基因在植物调控网络中发挥的特殊功能具有重要意义。
稻属有24个种，目前已报道了 9个种的11个基因组 中WRKY转录因子的生物信息学鉴定和分析结果。
其中包括AA基因组的7个种：短舌野生稻95个、展颖野生稻93个、南方野生稻88个、尼瓦拉野生稻94个、普通野生稻94个、非洲栽培稻87个、亚洲栽培稻粳稻亚种日本晴98个、籼稻亚种明恢63和R498分别为94和98个。
还有B基因组的 斑点野生稻 94个和FF基因组的短花药野生稻83个。
GG基因组的疣粒野生稻是稻属中已知基因组最大的种，具有对白叶枯病菌高抗甚至免疫、抗虫、抗旱、耐荫等特性。
但疣粒野生稻基因组中WRKY转录因子系统的生物信息学分析及其在 抗病抗逆 中的作用还鲜有报道。
OgWRKY转录因子分类
OgWRKYs蛋白全长序列采用 MEGA11中的MUSCLE方法进行多序列比对 ，据发表的方法，按照其WRKY结构域进行分组，分组后的多序列比对结果通过DNAMAN软件进行可视化。
而染色体定位和共线性分析利用RagTag工具包基于参考基因组把疣粒野生稻基因组提升至染色体水平，TBtools软件获取染色体长度及OgWRKY基因在染色体上位置信息。
最后用在线软件MG2C进行基因染色体位置可视化，通过TBtools的MCScanX功能进行物种间共线性分析，并采用TBtools软件进行可视化。
利用MEGA11软件中的MUSCLE进行疣粒野生稻和粳稻日本晴WRKY转录因子WRKY结构域和 全长氨基酸序列 比对。
基于两个物种对齐的WRKY结构域和预测的完整蛋白序列，利用MEGA11构建neighbour-joining系统发育树，bootstrap复制为1000，最后使用ggtree对进化树进行美化。
利用OgWRKY蛋白全长序列构建 系统发育进化树 ，通过MEME在线工具预测分析保守基序，基序最大数目设置为10。
再利用TBtoolsv1.098769软件的GeneStructureView工具将OgWRKYs进化树数据、meme.xml文件和多序列比对的保守结构域位置信息绘制为OgWRKY家族的 系统发育进化树、保守基序分布、保守结构域组合图 。
使用MEGA11.0中的MUSCLE进行OgWRKYs蛋白的氨基酸全长序列比对和结构域分析，94个OgWRKY蛋白分为I、II、III和IV4组。
Ⅰ组有12个成员，含有两个WRKY结构域，其中含C2H2型锌指基序的为Ia亚组，含C2HC型锌指基序的为Ib亚组。
II组有52个成员，含有一个WRKY基序和C2H2型锌指基序，进一步根据 锌指基序的序列特征 又分为IIa、IIb、IIc、IId和IIe五个亚组。
IIa亚组含有CX5CPVKKKVQR基序；IIb亚组含有CX5CPV(R/K)KQVQRC基序；IIc亚组含有CX4C基序；IId亚组含有CX5CPARKHVER基序；IIe亚组含有CX5CARKV基序。
Ⅲ组有26个成员，含有一个WRKY基序和一个C2HC型锌指基序。IV组有4个成员，含有WRKY基序，但缺少锌指基序或锌指基序不完整。
OgWRKY转录因子系统发育分析
首先利用MUSCLE对94个OgWRKY蛋白的WRKY结构域序列进行比对，并利用MEGA11.0构建具有 1000个bootstrap重复的邻接进化树 。
分别聚在IIc1、IIe、Ⅲ和Ⅲ组，推测IV组WRKY基因可以通过其它任何WRKY基因组失去WRKY结构域的一部分衍生而来。
由WRKY结构域构建的系统发育树可能会遗漏一些基因进化的重要信息。为此，进一步利用OgWRKYs蛋白的氨基酸全长序列构建了NJ系统发育树。
结果显示， 蛋白氨基酸 全长系统发育树与域树总体相似，但也存在一些差异。
在结构域树中IIc亚组成员聚在2个分支中，蛋白氨基酸全长系统发育树中聚为IIc1、IIc2和IIc3三个分支。
随后在结构域树中IIc亚组成员OgWRKY35与IaC聚在一起，而在蛋白氨基酸全长系统发育树中位于IIc1分支中。
在结构域树中的Ⅱd亚组成员OgWRKY6在蛋白氨基酸全长系统发育树中却与Ⅱe亚组成员聚在一起。
还有结构域树中Ⅱe亚组成员OgWRKY109，在蛋白氨基酸全长系统发育树中与Ⅱd亚组成员聚在同一分支。
蛋白氨基酸全长系统发育树聚在一起的成员，在氨基酸序列上具有较高的同源性。
为了进一步了解OgWRKY蛋白基序的相似性和多样性，使用MEMEOnline软件对OgWRKY蛋白的10个保守基序进行了分析。
结果显示， 不同OgWRKY蛋白中含有motif数量1~7个不等 ，同一组或亚组的OgWRKYs具有基本一致的保守基序，Ia亚组基序数量最多，含有7个motif。
motif1位于I组的C端WRKY结构域，motif3位于N端WRKY结构域。除Ⅳ组OgWRKY66b外，所有OgWRKY蛋白均含有motif1，而motif3仅存在于Ia亚组蛋白中。
在Ⅰa亚组中，C端WRKY结构域主要由motif1，motif2，motif4和motif7组成， 而Ⅱc亚组WRKY结构域基序与其基本一致 。
Ⅰa亚组N端WRKY结构域含有motif3、motif6和motif10，motif10为Ⅰa亚组N端WRKY结构域所特有。
在Ⅰb亚组中，N端和C端WRKY结构域都含有motif1和motif2，与半数Ⅲ组WRKY家族成员的所含基序一致。
这与专家认为Ib亚组WRKY家族基因可能通过C2HC型WRKY结构域的复制， 从III组WRKY家族基因进化而来的推论一致 。
此外，Ⅲ组一些成员的WRKY结构域还含有特有的motif5。IIa和IIb亚组含有基序motif1、motif2、motif7和motif9，motif9为其特有。
IId和IIe亚组含有共同基序motif1、motif2和motif8，motif8为IId和IIe亚组所特有。IId和IIe亚组区别在于，IIe亚组除OgWRKY31外，其余蛋白皆含有motif7。
而IId亚组只有OgWRKY6含有motif7，这可能就是OgWRKY6与IIe亚组聚在一起的原因。
除此之外，OgWRKY57也含有Motif6，这可能就是OgWRKY57与Ⅰa亚组N端WRKY结构域聚在一起的原因。
本次对94个OgWRKYs转录因子进行 KEGG富集分析 ，其中13个富集在植物-病原互作通路的OgWRKYs进一步结合基因启动子区域进行顺式作用元件分析。
推测OgWRKY30b、OgWRKY53、OgWRKY88、OgWRKY96和OgWRKY111在疣粒野生稻响应生物和非生物逆境中具有重要作用。