编译：微科盟 伊一，编辑：微科盟 景行、江舜尧。
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导读
虽然人们已经广泛研究了暗诱导和光诱导对植物形态发生的调控机制，但还没有系统地探索花生单细胞分辨率的生物过程。 本研究基于在黑暗和光照条件下生长的一周龄花生幼苗叶片中的13409和11296个单细胞，利用scRNA-seq鉴定的标记基因对10个细胞群进行了表征 。 6104个基因和50个转录因子（TFs）在不同的细胞簇中显示出显著的表达模式 ，这为分析黑暗/光照诱导的候选基因提供了基因资源。 进一步的拟时序轨迹和细胞周期证据证明，黑暗抑制了细胞分裂，扰乱了正常的细胞周期，尤其是PORA丰度与叶绿体中高度富集的11个TFs相关，限制了叶绿素的合成 。此外， 光照通过抑制生长素途径抑制了表皮细胞发育轨迹的延伸，21个TFs可能促成了不同基因的转录动态 。最终， 研究者从差异表达的TFs图谱中发现了花生AHL17，其编码的蛋白位于细胞核中，通过调节植物激素途径异位过表达时，可促进拟南芥叶片表皮细胞增大 。总之，本研究展示了花生黄化苗和绿化苗的不同基因图谱，为在单细胞水平上阐明光诱导的叶细胞发育提供了新的生物学见解。
论文ID
原名： ScRNA-seq reveals dark- and light-induced differentially expressed gene atlases of seedling leaves in Arachis hypogaea L.
译名： ScRNA-seq揭示了花生幼苗叶片在黑暗和光照诱导下的差异表达基因图谱
期刊： Plant Biotechnology Journal
IF： 13.8
发表时间： 2024年2月
通讯作者： 刘浩、陈小平、梁炫强，Rajeev K. Varshney
通讯作者单位： 广东省农业科学院作物研究所，澳大利亚莫道克大学
DOI号： 10.1111/pbi.14306
实验设计
结果
1 光、暗条件下花生幼苗的表型研究
研究者在种子萌发后1周内记录了花生幼苗表型 （图1a，图S1）。种子萌发后第3天，芽顶端分生组织（SAM）逐渐形成叶芽，但叶片紧闭，没有展开。 研究者对幼苗外胚轴长度和叶面积的测量表明，黑暗环境下生长的幼苗比光照调节下的幼苗生长更快 （图1b、c，图S1）。此外，在第一片真叶的生长过程中，黑暗环境下生长的幼苗的下胚轴、外胚轴和叶片长度均长于光照下生长的幼苗。然而，在第5天，叶片宽度和叶柄长度在光照和黑暗条件下生长的幼苗之间并无显著差异（图1d-g，图S1）。黑暗种植能明显促进植物外胚轴、下胚轴和叶柄的伸长。与黑暗种植苗相比，光照种植幼苗的第一片真叶为捕捉阳光而膨大，叶片更大。而黄化幼苗的叶片和叶脉都呈卷曲状，这表明黑暗条件抑制了叶片的伸展（图1h-k，图S1）。 因此，研究者对在黑暗和光照条件下生长的花生幼苗的形态观察表明，光照会抑制植物幼苗的生长 。这些发现为进一步研究不同光照条件下花生植株的生长机制提供了基本信息。
图1.在光照和黑暗条件下生长的花生幼苗的表型变化。 （a）第3天、第5天和第7天黄化苗（在黑暗条件下生长）和绿化苗（在光照条件下生长）的生长概况。（b、c）第3天暗生和光生幼苗的外胚轴长度、叶片长度和宽度（** P ＜0.01）。（d-g）第5天暗生苗和光生幼苗的下胚轴、上胚轴和叶柄长度、叶长和叶宽（* P ＜0.05，** P ＜0.01）。（h-k）第7天暗生和光生苗的下胚轴、外胚轴和叶柄长度、叶长和叶宽（* P ＜0.05，** P ＜0.01）。
2 花生叶scRNA-seq和主要细胞簇评估
尽管目前对光-暗诱导的幼苗萌发进行了大量的表型观察和多组学研究，也揭示了调控光形态发生的功能基因，但在花生中尚未发现暗-光环境下叶细胞分化过程中的单细胞转录组动态。 在本研究中，为了解读特定细胞群水平下的转录组图谱，研究者以幼苗叶片作为表征单细胞基因表达图谱的理想材料 。在此， 研究者通过优化细胞壁消化液中纤维素酶和果胶酶的配制比例，开发了一种高效的原生质体分离方案，并从一周龄幼苗的叶片中提取了完整的原生质体 （图2a，图S2）。共 分离出800个细胞/升（暗）和682个细胞/升（亮），将近49104个细胞装入微流控平台，进行条形码连接和文库构建。
在过滤重复、低质量细胞和基因后， 黑暗和光照条件下的两组分别捕获了13429和12209个细胞 （图2d，表S1）。光和黑暗条件下的细胞的测序数据分别产生了403282586和420629752个原始读数。此外，原始读数被映射到 A.hypogaea 参考基因组（表S1）。 数据质量控制显示，在黑暗和光明条件下，分别有1960和2507个过滤的UMI（唯一分子指数）和1348和1461个基因被分配到每个细胞中 （表S1、S2、图S3）。 随后，研究者应用FPKM值确定了总共49882个基因，并将其表达丰度锚定在由20条花生染色体组成的环形图中，以说明叶细胞的单细胞基因表达谱 （图2h，表S3）。利用之前报道的不同叶细胞的标记基因确定了两组高质量细胞，这有助于确定细胞群的类型，并利用主成分分析和t分布随机邻域嵌入（t-SNE）及均匀流形逼近和投影（UMAP）方法将数据结果可视化（图2b，图S4）。 两个样本中的13429个和11296个高质量细胞被分为10个细胞簇 （图2c、e、f）。其中，黑暗条件下的样本每个细胞簇中的单细胞数量从2到7508个不等，而光照条件下的样本则从86到4392个不等，其中大部分属于表皮细胞（图2d）。
为了确定已识别细胞簇的细胞类型，研究者首先收集了一批花生基因组中报告的特定叶细胞的标记基因，然后使用t-SNE进行可视化 （图2h、图S5、表S4）。最大的细胞簇被归类为表皮细胞，并通过这些细胞群中的主要表达基因（如DEHYDRIN DHN3-LIKE（DHN3）和SCARECROW-LIKE PROTEIN 1（SCL1））进行检测。 研究者 利用EARLY NODULIN-LIKE PROTEIN 1（ENODL）和PROBABLE GAMMA-SECRETASE SUBUNIT PEN-2 ISOFORM X1（PEN2）的表达分布来确定叶原基。此外，参与光合作用的RIBULOSE 1,5-BISPHOSPHATE CARBOXYLASE/OXYGENASE LARGE SUBUNIT（RBCS）,CHLOROPHYLL A-B BINDING PROTEIN CP24 10A, CHLOROPLASTIC（CAP10A）和26S PROTEASOME NON-ATPASE REGULATORY SUBUNIT 2 HOMOLOG A（RPN1A）在叶肉细胞中高度富集。维管细胞富含SUGAR TRANSPORT PROTEIN 13（STP13）的转录本。气孔保卫细胞的标记基因PROBABLE WRKY TRANSCRIPTION FACTOR 30（WRKY30）在细胞簇9中显示出独特的表达谱。同时，NON-SPECIFIC LIPID-TRANSFER PROTEIN-LIKE PROTEIN（LTPG31）在主质细胞中高表达。
研究者通过细胞特异性组织分离和实时PCR验证了不同细胞群中标记基因的真实表达水平 （图S6）。 研究者根据细胞群特异性表达的差异表达基因（DEGs）对叶绿体、表皮、维管束、主质细胞、原基细胞和气孔细胞等六种细胞类型进行了分组 （图2g）。重要的是，与光照条件下的幼苗相比，黑暗条件下幼苗所有细胞的基因表达分布更为集中，这有助于展示黑暗/光照条件下不同细胞类型的基因表达分布（图2e,f）。此外， 为了深入了解每个细胞团簇的分子功能，研究者选择了每个细胞团簇中表达水平最高的前五个基因进行GO或KEGG功能注释 （图2i，图S7，表S5）。 从KEGG中可以看出，主要细胞群的富集通路主要涉及新陈代谢和能量代谢 （表S5）。 本研究证明，scRNA-seq可以通过标记基因区分细胞类型并对富集基因进行注释，从而加速功能基因组学的解析和相关基因的鉴定 ，因此可以作为花生功能基因组学研究的宝贵资源。
图2.一周龄花生幼苗和绿苗的scRNA-seq和细胞簇分类步骤。 （a）花生叶片原生质体的分离、109基因组学平台加载和基因组锚定的简要方案。（b）tSNE图显示了黄化苗和绿化苗的叶细胞簇。每个点代表一个细胞。光照和暗生长幼苗的细胞分别用蓝色和红色表示。（c）10种颜色代表10个不同的scRNA-seq鉴定出的细胞簇。（d）柱状图表示在黄化苗和绿化苗中捕获的细胞数量及其在10个细胞簇中的分布。（e，f）分别为黄化苗和绿化苗的叶片细胞簇。（g）细胞簇0-9属于各自的细胞类型，气泡图说明了细胞簇标记基因的表达模式和分布。（h）圆环图表示通过scRNA-seq在花生叶细胞中DEGs的全基因组表达。从外侧到内侧轨道上的0-9数字代表不同的细胞簇。总的来说，circos图代表了花生基因组中20条染色体上所有细胞群DEGs的表达情况。（i）热图显示了每个细胞簇中表达水平最高的前五个DEGs。
3 鉴定不同细胞簇和经光/暗处理的幼苗叶片中的DEGs和转录因子
为了确定花生叶细胞簇和发育轨迹中的核心-DEGs，研究者应用拟时序轨迹分析了每个细胞簇中的差异表达基因 。首先， 评估了每个细胞簇中分布在18至1755个范围内的相关上调DEGs，并通过韦恩图统计了各细胞簇中的核心差异表达基因，以确定细胞亚群中的DEGs （图3a、b，表S2、S6）。由于转录因子（TFs）提供了基因表达的转录动力， 研究者将重点放在了重要转录因子的鉴定上 。同样， 研究者同时筛选了核心TFs和94个TFs，利用气泡热图和KEGG功能注释将它们的表达模式可视化 。基于其保守的结构域，这些TFs参与了重要的通路，如光周期、激素通路、JA通路、辅助素通路、乙烯通路、信号转导、环境适应和生物系统（图3c，d，表S7）。
此外， 研究者还分析了样本间的DEGs，以缩小目标DEGs和TFs的数量。通过比较黄化样本和绿色样本中的DEGs，评估了不同细胞群中上调和下调的DEGs （图3e，表S8）。 通过对黄化苗和绿化苗细胞亚簇的组间表达差异分析，研究者在细胞簇0、3和4中总共发现了50个与植物-病原体相互作用和植物激素信号转导相关的核心TFs 。此外， 还根据折叠变化和 P 值筛选出了10个目标TFs，并通过t-SNE图进行了表征 （图3f-i，表S9）。10个核心TFs在每个细胞中的表达模式显示，转录本MYB3、NAC29、AHL17、ERF98、ZAT11和CCH20在黄化幼苗的大多数细胞类型中高表达，而BBX25和NFYC1在绿化幼苗中高表达（图3f-i，表S9）。核心DEGs的鉴定为下一步说明花生细胞在不同光照环境下分化不同过程的关键基因提供了基因资源。
4 光促进了叶细胞分化的发育轨迹
随后，研究者利用拟时序分析法研究了叶绿体和绿苗所有细胞中DEGs表达的时空分布，并划分出叶细胞分化发育的五种细胞状态 （图3j，表S10）。 研究者确定了12696个DEGs，细胞分化在主枝上有两个分支节点 （图3j，表S11）。 为了了解细胞分化轨迹的基因表达动态，研究者对55个TFs进行了拟时序的分层聚类分析 ，这些TFs在黄化苗（图3k）和细胞状态1-3中高表达，涉及植物与病原体相互作用和植物激素信号通路（表S12）。此外，有11598个DEGs与分化状态相关，特别是分化轨迹始于状态1至5的细胞（图3j，表S13）。此外，有48个TFs与这些不同状态的细胞状态分布相关（图3l，表S14）。另一方面，研究了10250个DEGs，以了解幼苗细胞簇从叶绿体生长到去叶绿体形态发生的拟时序轨迹主干的细胞分化趋向（图3j，表S15）。其中有35个TFs特异性地参与了决定细胞命运的分支节点1（图3m，表S16）。重要的是， 研究者从与发育轨迹、细胞分化状态和细胞命运相关的三种状态的TFs中筛选出了29个核心TFs，并通过韦恩图和表达趋势热图进行了直观展示 （图3n，图S8）。
根据其KEGG功能注释，这些TFs参与了激素调节、信号转导和环境适应途径（表S17）。总之， 研究结果揭示了花生幼苗叶片和绿苗叶片之间的细胞分化和发育过程，并发现了这一生物学过程中的关键DEGs和TFs 。 为了探讨核心TFs的单细胞表达是否反映了花生幼叶和绿苗叶发育过程中的真实组织转录模式，研究人员进一步利用批量RNA-seq对其表达进行了验证，结果表明这15个TFs在两种RNA-seq图谱中均有表达 （图S9，表S18）。 接下来，随着黑暗和光照条件下叶片的膨大，对4364个DEGs（2029个上调，2335个下调）进行了评估，筛选出51个与植物激素调控通路相关的核心TFs （图S9，表S19）。 从黑暗生长条件到光照生长条件的不同基因表达模式表明，光照驱动了核心TFs的表达，从而介导了叶细胞的分化。
总体而言， 黄化幼苗的细胞分布集中在第1支，而绿化幼苗则富集在第2支，这表明两种条件（暗态和光照）下的细胞发育轨迹存在巨大差异 。 DEGs和TFs的表达趋势提供了转录组的动态变化，其中光合作用DEGs仍然主导着分化差异，尤其是在细胞状态3时暗细胞向光细胞演化的过程中 。因此，光似乎是一种催化剂，能加快从黄化细胞转化为绿苗细胞的分化速度。
图3.各细胞簇中DEGs的详细情况以及对一周龄黄化花生幼苗和绿花生幼苗叶片中细胞类型的拟时序轨迹分析。 （a）各细胞簇中DEGs的数量。（b、c）所有细胞类型中核心和特定DEGs及TFs的韦恩图。（d）气泡热图显示了各细胞簇中核心-TFs的聚类和KEGG通路富集分析。（e）各细胞群中上调和下调DEGs的柱状图。（f）热图表示在黑暗和光照处理下每个细胞簇中核心-TFs的平均表达水平。（g-i）10个核心-TFs在所有细胞簇中的表达分布特征图。（j）DEGs在细胞分化状态、样本信息和细胞簇中的分布，沿着叶细胞发育的拟时序进程。（k）55个细胞分化TFs在拟时序进程中的聚类和表达模式。（l）参与细胞分化状态的48个TFs的表达。（m）热图显示了参与细胞命运决定的35个DEGs。横坐标为拟时序点（拟时序点从中间向两侧逐渐增加），纵坐标为分支差异基因。（n）韦恩图显示了细胞分化、细胞状态分化和细胞命运的核心和特异性TFs。
5 scRNA-seq显示黑暗条件扰乱了叶片细胞周期
光照通过调节植物激素强烈改变植物的生长和发育，而植物激素协同调节细胞周期的进展。细胞周期阶段反映了scRNA-seq过程中的转录异质性。 在本研究中，研究者研究了细胞周期G1期（9个）、G1S期（433个）、S期（609个）、G2M期（144个）、M期（0个）和非周期性期（491个）的基因表达 （图S10a，表S20）。此外， 研究者还利用环状图分别展示了各簇所有细胞在光照和黑暗条件下细胞周期各期和非细胞周期各期的基因表达分析，观察到大部分黑暗叶片细胞处于S期 （图4a,b，图S10b,c，表S20）。此外， 研究者还利用速度涡度对每个细胞簇中的DEGs进行了RNA速度分析 ，通过为每个细胞画一个箭头将速度涡度可视化，从而将实际状态与估计的未来状态联系起来。此外， RNA速度动态生成了五个矢量，指向不同的轨迹场，表明细胞的发展方向 （图S10d）。正如分析所预期的那样，黄化苗细胞的表皮细胞簇（向量1和5）的RNA速度变化很小（短箭头或无箭头），而绿化苗细胞的转录轮廓变化较大（图S10e,f）。同时， 根据基因表达水平和细胞百分比这两个参数，研究者利用气泡热图直观地显示了细胞周期各阶段每个亚簇的前五个DEGs，以显示细胞周期中上调基因的分布情况 （图4c，表S21）。 细胞周期和RNA速度分析表明，与绿色幼苗相比，长期黑暗条件破坏了正常的细胞周期过程 。研究者推测，非自养黑暗幼苗不进行光合作用反应是一个主要因素，这间接降低了细胞分化的内在动力。
由于暗苗细胞进入了S期（图4a）， 研究者接下来探讨了DEGs图谱中的TFs。74个TFs在细胞周期的S期和其他阶段之间也有不同的表达模式，这促进了在黑暗和光照条件下生长的幼苗细胞周期之间转录组的异质性 （图4d）。 研究者利用tSNE图显示了在特定细胞群中高表达的10个TFs （P值=0）的分布密度（图4e）。有趣的是，包括AHL17、ERF98、NAC29、WRKY31和ZAT11在内的核心TFs在黄化幼苗的细胞中高表达，而NAC2在两种幼苗中均动态表达。在此， 研究者证明了scRNA-seq技术在揭示细胞周期各阶段的细胞转录异质性方面的实用性，并确定了与前一种细胞类型异质性相关的特异性和一致性表达的关键TFs （图4e）。这一结果提供了一个潜在的TFs库，用于进一步证明调节暗色和浅色秧苗叶片细胞周期差异的关键基因的功能细节。
图4.一周龄幼苗和绿苗叶片在细胞周期各阶段差异表达基因的分布。 （a）循环图显示了幼苗和绿苗与细胞周期各阶段的对应关系。G1、G1S、S、G1M和M是细胞周期的各个阶段。圆圈内不同颜色的链接代表细胞周期不同阶段所对应的不同细胞群。链接的宽度代表细胞的数量。例如，线条越粗代表细胞越多。（b）百分比堆叠条形图表示每个细胞簇中处于细胞周期不同阶段的细胞比例。各种颜色代表细胞周期的不同阶段，相应颜色矩形的长度与处于该特定时期的细胞比例成正比。（c）每个细胞簇中前五个DEGs在细胞周期各阶段的平均表达水平。气泡越大，代表每个阶段上调基因表达量总和的比例越高。气泡颜色越深，表示上调基因的表达量越高。（d）热图显示了上调TFs在S期和其他期细胞中的平均表达量。（e）图中显示了在细胞周期S期中比例较高（＞50%）的代表性TFs在不同细胞群中的表达情况。
6 黑暗环境抑制叶肉细胞分化和叶绿素合成
为了从单细胞水平了解黑暗环境抑制叶绿素生成的机理，研究者对叶绿素生成的表型进行了研究。研究者提取了叶肉细胞重建发育轨迹 （图5a） ，拟时序轨迹包含三种细胞分化状态，暗细胞主要富集在状态1中 （图5b，表S22-S24）。 研究者从细胞轨迹、状态和命运DEGs图谱中又确定了631个核心DEGs（图5c），这些DEGs涉及核糖体和光合作用途径 （图5d）。其中，22个TFs响应基因调控途径，调节叶绿体间质分化（图5e,f）。 结果表明，光照可增强叶肉分化能力，而黑暗则产生相反的影响。
此外，暗细胞发育抑制了叶绿素的合成，尤其是关键酶PORA（原叶绿素还原酶，来自2个子基因组的2个基因）转录丰度在暗叶肉细胞簇中高表达（图5g），PORA表达水平在暗细胞转化为亮细胞的过程中下调，这与细胞从1态发育到2-3态的分化调控密切相关。此外，其他叶绿素合成限制酶DVR（Divinyl chlorophyllide an 8-Vinyl Reductase）的mRNA也呈现出与PORA相似的结果，但在暗细胞分化中并不占主导地位（图5h）。PORA的高表达可能受11个TFs的控制，这些TFs在暗色叶肉细胞中表现出与PORA相似的表达趋势（图5i）。因此， 研究者提出了一个模型（图5j），即在黑暗条件下，PORA和DVR在叶肉中的表达水平上调，以限制pchlide转化为叶绿素的过程。当叶片接受光照降解PORA和DVR mRNA后，由于叶绿素的合成，幼苗叶片恢复绿色。
图5.不同光照条件下叶肉细胞的发育轨迹。 （a）t-SNE图中叶肉细胞（第1、4、5组）的分布。（b）叶肉细胞假时发育轨迹和分化状态。（c）从轨迹、细胞状态和细胞命运图谱中识别核心DEGs。（d）涉及KEGG富集途径的631个DEGs。（e）631个DEGs图谱中的22个差异表达TFs。（f）22个TFs丰富了GO术语。（g）细胞分布图、叶绿体间质发育轨迹和细胞状态中PORA的表达模式。（h）DVR在细胞分布图、叶绿体间质发育轨迹和细胞状态中的表达模式。（i）叶肉细胞分布图中11种TFs的表达模式。（j）基于scRNA-seq结果的不同光照环境下叶绿素合成模型。
7 暗条件通过植物激素途径促进表皮细胞的扩张
表皮细胞是研究植物细胞形态发生的模型细胞。表皮细胞受植物激素的影响，相互交错生长，从而在二维平面上产生拼图状细胞。 研究者根据叶片表皮细胞切片的透射电镜和扫描电镜结果，观察到在第3天、第5天和第7天，黄化苗的叶片表皮细胞长度和面积明显大于绿化苗 ，分别为7.78%-10.02%和13.43%-24.11%（图6a,b）。
此外， 为了探索花生叶片表皮细胞在黑暗和光照条件下的分化和发育过程，研究者分离了表皮细胞群，尤其是细胞簇0和细胞簇3，并重建了表皮细胞的发育轨迹 （图6c，表S3）。表皮细胞簇0和3经过重新组合，分别得到4个和2个细胞亚簇（图6d）。 通过拟时序轨迹分析了解表皮细胞的发育过程，沿着时间轴的主干共鉴定出8551个DEGs，而所有细胞被分为三种分化状态，与这三种不同状态相关的DEGs共有8191个 （表S25，图6e）。重要的是， 在三种状态中，状态1的细胞沿着构建的发育轨迹分布在"起点"附近的主茎上，然后细胞分化产生两个分支，进一步分别分化为状态2和状态3，共有421个TFs在这些细胞中差异表达 （表S26、S27，图6e）。此外，黄化幼苗表皮细胞的发育轨迹的一个分支点集中在发育初始位置，而绿化幼苗细胞则聚集在另一个分支点， 这表明花生绿苗和黄化幼苗的转录组重新编程具有多样性 （图6e）。 研究者根据 P 值对TF图谱进行筛选后，共鉴定出21个TFs，而这21个TFs的表达水平随着拟时序线的变化而逐渐降低，这些转录本的功能与植物激素的调控有关 （表S27，图6f）。具体而言，这些具有同源基因的TFs被划分为AHL、NAC、MYB、ZAT、WRKY、SAP和ERF等基因家族，这些TFs的表达和分布在t-SNE图中被可视化（图6g,h）。 从结果来看，只有两个NAC2在表皮细胞分化状态1-2与状态1-3的图谱中表达不同，它们可能在表皮细胞命运分化中起着重要作用 （图6f-i，表S26）。
据广泛报道，植物激素在生长发育过程中发挥着各种重要作用。植物激素的功能受光照条件的调节，这是光照调节植物生长发育的基础。例如，脱落酸（ABA）抑制种子萌发，赤霉素（GA）促进种子萌发，这一过程受光信号调控。 为了进一步揭示这一现象，研究者研究了花生幼苗叶片在黑暗和光照条件下的植物激素含量。 结果发现，与光照下生长的幼苗相比，黑暗条件下生长的幼苗的GA4、乙烯/1-氨基环丙烷羧酸（ETH/ACC）、吲哚-3-乙酸（IAA）和细胞分裂素（CTK）含量明显较高。然而，光照下生长的幼苗的ABA和茉莉酸（JA）含量明显较高。水杨酸（SA）含量在光照和黑暗生长的幼苗中没有明显差异（图6j,k）。植物激素相关基因组的相对表达也表明，与绿苗相比，IAA、ETH和GA基因在黄化花生苗中的表达量明显较高（图6l，表S28）。 总之，共鉴定出21个TFs和10个枢纽基因及其同源基因，它们可能是花生叶表皮细胞在不同光照环境下差异的重要候选驱动因子。
图6.scRNA-Seq用于全面分析叶片表皮细胞的差异表达基因和转录因子以及黄化苗和绿化苗的激素谱。 （a）叶片表皮细胞的透射和扫描电子显微镜分析。（b）小提琴图表示叶片表皮细胞的长度和面积（* P ＜0.05，** P ＜0.01）。（c）表皮细胞簇0和3的分布模式。每个点代表一个细胞。（d）t-SNE图显示了0号和3号表皮细胞簇第二轮聚类后的子簇，以及它们在暗处理和光处理中的分布。（e）表皮细胞拟时序分化轨迹分析，四幅图分别基于拟时序、细胞状态、样本类型和细胞簇。‘Start’表示拟时序的开始。（f）21个TFs沿拟时序轨迹的聚类和表达动力学。（g）参与表皮细胞发育的核心TF家族（AHL、NAC、MYB、ZAT、WRKY、SAP和ERF）表达分布的拟时序轨迹。（h）表皮细胞中NAC2、WRKY31、ZAT11、AHL17和ERF98的表达模式。（i）散点图显示了NAC2表达水平的分支轨迹和拟时序线。横坐标为拟时序轴；纵坐标为基因表达的分支差异。三种颜色代表细胞分化的三种状态。实线和虚线代表不同的分支。（j，k）柱状图显示了暗生和光生幼苗中上调的植物激素（* P ＜0.05，** P ＜0.01）。（l）暗生和光生花生幼苗中植物激素调控基因组的相对表达量（** P ＜0.01）。
8 花生AHL17的异位表达促进了拟南芥叶片的生长
如上所述，研究者挖掘了参与细胞发育拟时序轨迹和细胞周期各阶段的关键TFs，如AHL17、MYB3、NAC29、BBX25、ZAT11、NAC2、ERF98和WRKY31。此外， 研究者还提取了表皮细胞集群进行亚集群，并确定了参与调控重要植物激素的TFs。 由于AHL17的转录组非常丰富（图S11）， 研究者重点阐述了AHL17（Arahy.6X9KLT）（图S12）的生物功能与表达模式 （图3g、4e、6h）。AHL17在不同生长阶段的不同花生组织（叶、根、茎、荚果、种子和豆荚）中高表达，尤其是在叶、荚果和种子中，表明其具有明显的组织特异性表达模式（图S13a,b）。此外，AHL17的表达在黄化苗和绿化苗之间有显著差异，在黄化苗的表皮细胞中达到峰值（图S13c,d）。上述从组织到单细胞水平的表达结果表明， AHL17可能具有调控各种组织发育的多种特异功能 。AHL17是一种AT钩基序核定位蛋白17-like，编码一种含有310个氨基酸的未定性蛋白（图7a）。 系统进化分析表明，AHL17与第3组中的AtAHL1和AtAHL10相似（图7b）。随后的亚细胞定位显示，AHL17-GFP锚定的细胞器是拟南芥原生质体细胞核，表明AHL17蛋白主要定位于细胞核 （图7c）。此外， 通过DNA亲和纯化测序（DAP-Seq）富集了AHL17蛋白在花生基因组中的结合位点，检测到5个短基序，其中AA（T）AAAATA是AHL17蛋白的主要保守基序 （图S14，表S30，S31）。
此外， 研究者在拟南芥中异位过表达AHL17，产生AHL17-OE转基因株系，并比较其在不同生长阶段，如萌发期、幼苗期和开花期，在光照和黑暗条件下的表型 （图7d-i）。在萌发期和幼苗期，与野生型（WT）和空质粒（pBWA（V）HS）相比，过表达的AHL17-OE株系的子叶长度和宽度都明显增大，从整个植株的大小来看，AHL17-OE株系的生长速度也明显加快（图7d-g）。在开花期，与WT和pBWA（V）HS相比，AHL17-OE株系的叶片尺寸扩大和整株植株扩大的程度都有所提高（图7h,i）。与WT和pBWA（V）HS相比，AHL17-OE株系在黑暗条件下的叶片大小在幼苗期没有明显变化。此外， 研究者对WT、pBWA（V）HS和AHL17-OE的叶片进行的扫描电镜观察表明，与WT和pBWA（V）HS相比，AHL17的过表达增加了各生长阶段表皮细胞的面积 （图7j、k，图S15、S16）。 这些结果表明，AHL17能正向调节表皮细胞的增大，从而促进叶片扩展，导致植株增大 。然而，AHL17-OE的提早开花机制尚不清楚。由于scRNA-seq结果表明AHL17参与了植物激素途径的调控。为了证明这一点， 研究者收集了过表达AHL17-OE的拟南芥叶片组织的三个阶段，利用LC-MS进行植物激素分析 。与WT和pBWA（V）HS相比，AHL17-OE株系的IAA、CTK和乙烯前体1-aminocyclopropane-1-carboxylicacid（ACC）含量显著增加（图7l）。此外，还通过qPCR检测了这些植物激素生物合成途径中关键基因的真实表达水平（图S17）。与在黑暗条件下生长的WT和pBWA（V）HS相比，AHL17-OE株系中YUCCA（黄素单加氧酶）（IAA）和ACS（ACC合酶）（ETH）的表达水平较高（图S17a,c）。细胞分裂素合成基因CYP735A（细胞色素P450超家族蛋白）和LOG（LONELY GUY）在黑暗条件下的表达量特别高（图S17b）。此外， 研究者根据DAP-Seq注释筛选出245个基因，这些基因主要与IAA、CTK和ETH的合成有关 （表S32）。 因此，研究者推测AHL17在调控植物激素途径和促进叶片表皮细胞增大方面发挥了重要作用 （图7m）。
图7.拟南芥中花生AHL17基因的过表达及AtAHL17-OE与野生型的比较。 （a）AHL17蛋白结构示意图。（b）拟南芥中AhAHL17同源基因的系统发生树。（c）AHL17蛋白在拟南芥原生质体细胞核中的亚细胞定位。标尺为10μm。（d、f、h）在黑暗和光照条件下，WT、pBWA（V）HS和AHL17-OE株系在种子萌发、幼苗和开花阶段的表型比较。（e、g、i）WT、pBWA（V）HS和AHL17-OE株系植株叶片长度和宽度的测量（n=10）（* P ＜0.05，** P ＜0.01）。（j）WT、pBWA（V）HS和AHL17-OE转基因品系幼苗期表皮细胞大小的扫描电子显微镜（SEM）分析。标尺为100μm。。（k）在黑暗和光照条件下，WT、pBWA（V）HS和AHL17-OE株系在发芽、幼苗和开花期的表皮细胞面积（n=30）（* P ＜0.05，** P ＜0.01）。（l）利用LC-MS生成WT、pBWA（V）HS和AHL17-OE植物的植物激素图谱。柱状图表示WT、pBWA（V）HS和AHL17-OE植物在光照和黑暗条件下的IAA、CTK和ACC含量（* P ＜0.05）。（m）花生AHL17蛋白在植物生长中的生物学功能推测模型。
讨论
花生因其独特的果实发育特征、气生花和地下果实发育而完全有别于其他作物。在研究者之前的研究中，花生荚果发育阶段的转录组图谱共发现了245个响应光刺激的基因、2个参与黑暗条件的基因和6个参与去叶的基因。此外，在黑暗条件下，研究者对与花生荚果发育相关的转录组编程（包括TF调控、植物激素信号传导和光合作用）有了更多的了解，这表明光抑制了气生荚果的膨大和胚胎发育，而地下果实的膨大则是由于没有光的诱导。重要的是，研究者之前的scRNA-seq研究发现，花生叶片的细胞分化命运是通过植物激素积累途径调控的。 本研究的单细胞转录组图谱描述了在黑暗和光照条件下生长的花生幼苗叶片细胞集群、细胞发育轨迹和细胞周期变化的多样性 。 scRNA-seq结果揭示了光照抑制花生的DEGs图谱，并探索了黑暗/光照生长叶片细胞的细胞和转录异质性 。此外， 本研究结果还为花生暗/光形态发生下的单细胞转录组基因图谱及其在叶片发育过程中的动态表达模式提供了新的见解。
1 scRNA-seq描述了在黑暗和光照条件下生长的花生幼苗的不同基因图谱
植物幼苗在接受光照后从黄化生长向去黄化形态发生的不可逆转变会引发植物组织的多种发育程序。一些重要研究报告指出，植物和叶片的形态转化被认为是植物在光照或黑暗条件下的关键反应。然而，由于技术上的限制，人们尚未利用单细胞转录组学研究这种转化背后的细胞发育过程。 在本研究中，植物scRNA-seq研究展示了其大规模高通量测定的技术优势，以及分析单细胞基因表达模式异质性的能力 ，如子叶叶脉发育和气孔基因谱轨迹。 本研究者利用酶解方法获得原生质体，并通过微流控平台生成scRNA-seq数据，构建了花生黄化和绿苗叶片的scRNA-seq图谱。
根据分析结果，研究者确定了六种细胞类型，即0-9号独特细胞群，尤其是在不同光照条件下表现出明显细胞分化状态的独特细胞群 。 光照生长的细胞比黑暗生长的细胞具有更多的分化状态，这表明光照条件增强了花生叶片的细胞分化动态。 这一生物学过程是由于与暗生细胞相比，光生细胞的光合作用反应产生了自养营养所需的碳水化合物，改变了每个光生细胞原始生长能量的供应方式和基因表达模式，导致光生细胞分化成更多的细胞分化状态。此外，每个细胞群的基因表达图谱都是通过其标记基因来表征的，体现了scRNA-seq的高精度。花生作为一种非模式植物，可用于识别细胞类型的标记基因报道很少。因此， 在本研究中，研究者使用拟南芥和花生基因之间的直接同源基因来识别花生细胞类型 。每个细胞簇的基因表达图谱都以其标记基因为特征，证明了scRNA-seq方法的可行性和效率。此外，该方法还为今后在非模式物种中通过scRNA-seq进行细胞类型鉴定提供了参考。 根据所识别的细胞类型，研究者还报告了每种花生叶细胞类型的标记基因，这些标记基因具有特异性表达，可能在叶片结构和功能的调控中发挥关键作用。
2 核心TFs的鉴定调控着叶细胞的发育
叶细胞的发育是一个持续的过程，伴随着重要的转录调控以及生理和代谢过程。在本研究中，scRNA-seq可促进对植物器官发育和所发现的关键调控基因的了解。 研究者通过scRNA-seq分析，观察到约65.18%的黄化幼苗细胞和47.32%的绿化幼苗细胞属于叶表皮细胞，具有植物激素基因表达模式 （图2）。相比之下，其余细胞分布在八个不同的细胞群中。 总体而言，表皮细胞数量居多为确定花生叶片形态发生过程中的关键通路提供了机会，并确定了叶细胞生长过程中的主要细胞发育过程和轨迹 。因此，通过对黑暗和光照条件下不同细胞类型*特中**异表达的DEGs和TFs进行KEGG和Venn图分析，可以深入了解各种叶片细胞的生物学功能。重要的是，来自AHL、MYB、NAC、ERF、ZAT、CCH和BBX家族的10个差异表达TFs被发现与光周期和植物激素途径有关（图3d-i）。以往研究表明，叶片形态转化的关键调控因子，如AHL、MYB、NAC和ERF，在叶片的特定发育阶段表达。
此外， 拟时序分析的结果表明，所有细胞都可以沿着一条主要的发育轨迹进行分类 （图3j）。 研究者对不同细胞状态、样本和细胞群分布的分析表明，不同细胞群中的细胞沿着拟时序轨迹相对独立地分布 。 研究者对不同分布的TFs的表达趋势分析表明，不同细胞簇中TFs的表达模式是一致的、动态的 。例如，除了BBX25的表达模式从高到低之外，其他所有TFs的表达水平都从低到高（图3g-n）。 研究者进一步的细胞周期和RNA速度分析表明，暗生长幼苗的表皮细胞具有较低的RNA代谢活性，这与它们在细胞周期的S期主要出清的状态相符 （图4a,b）。相比之下，光照生长的幼苗与黑暗生长的幼苗相比表现出较高的RNA代谢活性，表明光照生长的幼苗细胞与黑暗生长的幼苗相比具有较高的细胞分化率。因此， 上述结果表明，scRNA-seq可以重建细胞周期各阶段的叶细胞分化轨迹，从而准确挖掘出黄化苗和绿化苗中的关键基因。
3 在光照条件下促进了细胞的分化
光照通过降低生长素含量抑制幼苗发育，scRNA-seq构建的细胞发育轨迹表明，光照加速了暗细胞向光细胞进化过程中的细胞分化过程 ，类似现象在叶肉和表皮中普遍存在。有趣的是，叶肉中含有大量叶绿体，可以调节叶绿素转化为叶绿素苷，最后一步限制了PORA酶应该在叶肉簇中高表达，但研究者也发现PORA在表皮（0簇）中高表达。 scRNA-seq结果支持了一种新的推测，即在光刺激下，PORA mRNA首先在表皮降解，然后降解信号传导到叶肉，终止PORA对叶绿素合成的抑制作用。 此外， 当光诱导的光合作用反应恢复正常后，表皮细胞的分化动力在光环境下增强，从而降低了生长素含量，关闭了植物激素相关TFs的转录 。最后，scRNA-seq远远超越了传统的组织大容量转录组，在单细胞分辨率上为植物光发育生物学提供了一些新的生物学见解。
4 AHL17介导植物激素途径促进叶表皮细胞增大
AHL基因家族在陆生植物中高度保守，其特征是存在一个AThook基序和一个未知功能域DUF296。先前的研究表明，AHL蛋白调控植物的生长和发育过程，包括叶片膨大、花朵增大、下胚轴伸长等。尽管一些AHL基因参与了植物激素的调控，如ABA、JA和CTK。然而，对AHL蛋白家族的功能探索主要集中在拟南芥上，对花生中的功能很少有系统的描述。 在本研究中，研究者观察到暗生幼苗与光生幼苗的叶表皮细胞发育与AHL17转录因子有关。 在拟南芥中异位表达AHL17时，拟南芥AHL17-OE株系的叶片细胞面积显著扩大，叶片尺寸增大。此外， scRNA-seq结果表明，AHL17参与了植物激素的信号传导 。AHL17可激活对幼苗表皮发育至关重要的生长植物激素信号通路。因此，研究者证明AHL17在黑暗环境向光环境过渡期间至关重要。
植物AHLs（AHL22、AHL27、AHL20、AHL19）调节植物发育的多个方面，其中涉及植物激素的平衡或对其反应的调解，如增强赤霉素诱导的成叶生长（AHL25）、通过辅酶、乙烯、黄铜类固醇途径（SOB3/AHL29）拮抗促进生长的PIFs，限制叶柄伸长；通过细胞分裂素信号（AHL15）刺激骨架活性，延迟幼苗到成株的无性期变化。然而，根据DAP-seq的结果，AHL17编码蛋白位于细胞核中，与AA（T）AAAATA保守基序结合，激活花生基因组中涉及多种植物激素信号通路的下游基因表达，包括IAA9、YUCCA5、LOG3、CYP735A2和ACS，这些基因与辅助素、细胞分裂素和乙烯的合成有关（表S32）。因此， AHL17依靠多样性植物激素优先促进整个叶片的膨大，并在光照条件下从外部改善表皮的生长配比 。此外，用外源乙烯处理黑暗诱导的幼苗时，其表皮形态发生受乙烯信号的正向调节。同样， 本研究结果表明，AHL17-OE株系激素谱中乙烯前体ACC含量的变化与此相符。AHL17可能会上调ACS和ACO（ACC氧化酶），在黑暗环境下通过增加乙烯含量来加速表皮细胞的扩张 ，但这一假设还需要进一步的实验数据来验证。最后，花生AHL17通过激素途径介导植物生长的正向调控，其功能解释可能有助于加速花生育种，并扩展研究者对花生中AHLs分子细节的理解。
总之，本研究结果首次绘制了花生幼苗暗生和光生的转录组图谱，为识别花生叶细胞提供了新的标记基因，从而更系统、更准确地理解叶细胞的发育机制 。最后，研究者相信，scRNA-seq与其他单细胞或空间多组学的合作将在未来加速花生单细胞科学研究。