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转基因技术是植物基因功能研究的重要工具，在利用转基因技术研究植物基因时，目的基因的表达需要合适的启动子进行驱动。在传统的转基因实验中，应用比较广泛的是一些组成型强启动子，由其驱动的目的基因理论上在植物所有发育时期、所有组织中均会高表达，因此在很大程度上会增加转基因植物的代谢负担。诱导型启动子是植物在长期适应环境的过程中形成的一类能够响应特殊的生物、物理或化学信号的启动子，在没有诱导因子存在的条件下，其驱动的靶基因不表达或本底表达，一旦环境中出现诱导因子，靶基因的表达会迅速增加。因此，利用诱导型启动子来驱动转基因植物中的目的基因可以最大程度地减少对植物的负面影响。在本次的推文中，小远主要是想和大家分享一些诱导型启动子的应用案例，希望在大家选择启动子时有所帮助。
01 背景介绍
在正式阅读本篇文章之前，小远想先和大家一起回顾一下有关启动子的内容。启动子作为基因的重要组成部分，其主要功能是调控基因表达（转录）的起始时间和表达程度。然而，启动子本身并不控制基因活动，而是通过与转录因子的结合来控制基因活动。根据启动子对转录水平的调控程度，将其分为弱启动子和强启动子。此外，按照转录模式，其又可被分为：
（1）组成型启动子（Constitutive promoter），能够调控基因表达，使基因在不同组织或部位中的表达水平基本保持恒定；
（2）组织特异性启动子（Tissue specific promoter），使基因只在特定器官或组织中表达，且表现出发育调节的特性；
（3）诱导型启动子（Inducible promoter），即在某些特定的物理或化学信号刺激后，这类启动子可以有效调控基因的转录水平，使其显著提升。
接下来小远将为大家重点介绍有关诱导型启动子的应用案例。
02 生物胁迫诱导型启动子
植物在生长发育过程中会受到病原微生物、害虫等侵害，导致其存活率下降。生物胁迫诱导型启动子可以在植物受到生物胁迫时激活防御基因并调控其表达，从而对植物自身起到保护作用。
2.1病原菌诱导型启动子
当植物受到病原菌感染时，病原菌诱导型启动子会激活抗病相关基因的表达来提高植物的抗性。目前已经报道了多种病原菌诱导型启动子，例如大麦 Hv-Ger4c 基因的启动子(Himmelbach et al., 2010)、甘蓝型油菜 BnGH17 基因的启动子 pBnGH17D7 (Lin et al., 2022)、葡萄 VpWhy1 基因的启动子 pVp (Lai et al., 2022)、水稻Os2H16基因的启动子 POs2H16 (何康, 2016)和 OsERF96 基因的启动子(牟少亮等, 2017)等，接下来小远主要给大家介绍一下有关 Hv-Ger4c 启动子和 pBnGH17D7 启动子的应用案例。
2.1.1 Hv-Ger4c 启动子
锈病和*粉白**病是对麦类作物构成巨大威胁的两种真菌病害。在小麦中，编码ABC转运蛋白的 Lr34 基因以其广谱抗性而闻名，对于抵御这些真菌病害至关重要。将 Ta-Lr34res 基因在大麦中过量表达可以提高大麦对锈病和*粉白**病的抗性，但是由于 Ta-Lr34res 在其自身启动子的控制下在大麦的幼苗期就已经高度表达，从而产生了强叶尖坏死（LTN）表型，严重影响了产量(Risk et al., 2013)。
2018年1月，苏黎世大学Simon G. Krattinger和Beat Keller课题组在 Plant Biotechnology Journal 杂志上发表了一篇题为“Pathogen-inducible Ta-Lr34res expression in heterologous barley confers disease resistance without negative pleiotropic effects”的研究论文，作者选取了病原菌诱导的 Hv-Ger4c 启动子，其在臭氧、寒冷、受伤、紫外线照射或风等胁迫处理下不会被诱导。将小麦中的 Ta-Lr34res 基因在 Hv-Ger4c 启动子驱动下转化大麦，获得的转基因植株不仅具有抗病效果，且产量与不侵染病菌的植株无显著差异。
图1 Hv‑Ger4c::Ta‑Lr34res大麦显示叶尖坏死（LTN）降低，对生长的影响也降低(Boni et al., 2018)。
（a）为了评估LTN，取了五叶阶段大麦的第一片叶子，在温室条件下，虽然编号为8的 Hv‑Ger4c::Ta‑Lr34res 大麦表现出LTN，但是与由自身启动子驱动 Ta‑Lr34res 表达的BG9株系相比，LTN水平降低。（b）为了评估生长参数，将植物培养直至成熟，收获10株单独的植物并测定每株植物的籽粒重量。
2.1.2 pBnGH17D7
菌核病是一种常见且严重的油菜病害，给我国的油菜生产造成了巨大的损失。然而现有的油菜品种及其近缘种中缺乏有效抗源，导致油菜抗菌核病常规育种进展缓慢。利用诱导型启动子驱动防御基因的表达或采用寄主诱导的基因沉默（host induced gene silencing, HIGS）进行菌核病的抗性基因工程是非常有效的策略。因此，分离和鉴定核盘菌诱导型启动子有助于培育抗菌核病、产量稳定的甘蓝型油菜品种。
2022年11月，扬州大学王幼平和吴健课题组在 Journal of Experimental Botany 杂志上发表了一篇题为“The Sclerotinia sclerotiorum -inducible promoter pBnGH17D7 in Brassica napus : isolation, characterization, and application in host-induced gene silencing”的研究论文，作者在甘蓝型油菜中鉴定和克隆了核盘菌诱导型启动子 pBnGH17D7 ，并发现该启动子在非生物胁迫（冷、热、盐和干旱）和激素（茉莉酸甲酯、水杨酸、脱落酸和乙烯）处理下未被显著诱导。利用HIGS策略，将 pBnGH17D7驱动的RNAi载体转化甘蓝型油菜，对核盘菌致病关键基因SsPG1进行干扰，结果显示，仅在核盘菌侵染时，转基因油菜才能诱导表达大量核盘菌靶基因SsPG1的siRNAs以干扰核盘菌的侵染，从而提高油菜的菌核病抗性。
图2 甘蓝型油菜中核盘菌SsPG1的宿主诱导基因沉默（HIGS）(Lin et al., 2022)。
（A）HIGS载体示意图。（B）HIGS转基因T1植物未接种叶片（Mock）和接种叶片（ S.s ）中 SsPG1 的小RNA分析。（C、D、F、G）通过子叶接种（C、D）和离体叶片接种（F、G）来评估HIGS转基因甘蓝型油菜对核盘菌的抗病性，接种后48小时对接种位置的侵染情况进行拍照和测量。（E、H） SsPG1 在核盘菌感染的油菜子叶（E）和叶片（H）中的表达量。（I）在感染后24小时测定受核盘菌感染的油菜叶片中多聚半乳糖醛酸酶（PG）的活性。
2.2害虫诱导型启动子
采用生物技术手段对害虫进行防治是一种环境友好型的措施。利用组成型启动子驱动杀虫毒素基因的表达，虽然可以确保毒性蛋白在植物中持续表达来防止昆虫的侵食，但是也会带来巨大的代谢成本，并且有些毒性蛋白的表达会影响植物的发育。因此，更精准的表达这些杀虫毒素基因有助于优化抗虫作物的抗性。害虫诱导型启动子可以在植物未受到侵害时减少毒性蛋白不必要的表达，从而减轻对植物的负面影响。目前已经报道了多个这类启动子，包括玫瑰 RbPCD1 基因的启动子 RbPCD1pro (Amar Pal Singh, 2011; Pandey et al., 2019)、水稻 Os01g73940 基因的启动子 BPHIP (关丽梅等, 2016)和豆类牧草矮笔花豆（ Stylosanthes humilis ）过氧化物酶基因 Shpx6b 的启动子(Perera and Jones, 2004)等，接下来小远主要给大家介绍一下有关 RbPCD1pro 的应用案例。
2.2.1 RbPCD1pro
目前防治鳞翅目最流行的环境友好型生物技术方法之一是开发表达苏云金芽孢杆菌c ryIAc 基因及其变体的转基因植物。2019年7月，印度CSIR国家植物研究所Aniruddha P. Sane课题组在 Plant Biotechnology Journal 杂志上发表了一篇题为“A strong early acting wound-inducible promoter, RbPCD1pro, activates cryIAc expression within minutes of wounding to impart efficient protection against insects”的研究论文，报道了来自玫瑰的快速、早期创伤诱导型启动子 RbPCD1pro 在转基因植物中驱动 cryIAc 基因的功能。 RbPCD1pro 在植物受到机械损伤后5分钟内即可被激活，且 RbPCD1 基因的转录活性在5分钟内能增加至150倍、在20分钟内能增加至500倍，其翻译效率很高，组织中的GUS酶活性在5-20分钟内可被检测到。 RbPCD1pro 在大部分双子叶和单子叶植物的地上组织中可以被创伤诱导。在拟南芥和番茄中利用 RbPCD1pro 驱动 cryIAc 基因进行测试时，作者观察到昆虫对植物造成创伤后可强烈诱导CryIAc的表达。在拟南芥未受到创伤时 RbPCD1pro 驱动的表达量仅为 CaMV35S 驱动下的3-6%，而在创伤发生后的5分钟内， RbPCD1pro 驱动的表达量能达到 CaMV35S 驱动下的4.5-27倍，20分钟时则提升至11-82倍（图3）。并且，拟南芥和番茄转基因植物对较大的第四龄棉铃虫幼虫表现出强烈的抗性（图4、5），植物的生长也没有出现营养和生殖生长异常等问题。因此， RbPCD1pro 在单子叶植物和双子叶植物中具有广泛的生物技术应用潜力。
图3 在CaMV35S和RbPCD1启动子驱动下不同转基因株系中CryIAc的表达水平(Pandey et al., 2019)。
对于 CaMV35S 株系，使用CryIAc特异性抗体通过DAS-ELISA在叶片圆盘（177mm2）中估算表达水平。对于 RbPCD1pro::cryIAc 植株的伤口诱导表达，先将叶片用不同数量的刺孔（2、4和12）处理并保持5或20分钟，然后从植株上切取叶片圆盘再进行检测，UW表示未受伤，W表示受伤。
图4 在RbPCD1启动子驱动下表达cryIAc的转基因拟南芥植物对不同发育阶段的棉铃虫幼虫的抗性评估。
（a）不同 RbPCD1pro::cryIAc 转基因拟南芥植株叶片上喂养的各龄期幼虫死亡率随时间的变化。（b）通过对三个独立转基因系进行的叶片损伤（第一和第二龄幼虫）和整株植物损伤（第三和第四龄幼虫）检测，研究转基因 RbPCD1pro::cryIAc 拟南芥株系对不同发育阶段棉铃虫幼虫的抗性。
图5 CryIAc在创伤诱导下的表达以及RbPCD1启动子驱动表达CryIAc转基因植株对不同发育阶段棉铃虫幼虫抗性评估
（a）不同转基因番茄株系中CryIAc的表达。（b）不同 RbPCD1pro::cryIAc 转基因番茄株系叶片上喂养的各龄期幼虫死亡率随时间的变化。（c）通过对三个独立转基因系进行的叶片损伤（第一和第二龄幼虫）和整株植物损伤（第三和第四龄幼虫）检测，研究转基因 RbPCD1pro::cryIAc 番茄株系对不同发育阶段棉铃虫幼虫的抗性。
03 物理胁迫诱导型启动子
物理胁迫诱导型启动子是指能对光照、极端温度、干旱等逆境胁迫作出反应，使植物能够适应非正常光照、极端温度和干旱等恶劣环境，并维持其生长发育的一类启动子。关于这类启动子的研究开始的较早，相关的研究成果也最多。
3.1干旱诱导型启动子
在干旱条件下，植物的根毛细胞感知到干旱胁迫后，会通过信号转导来诱导干旱胁迫相关基因的表达。首个被发现的干旱诱导型启动子是拟南芥 rd29 基因的启动子(Yamaguchi-Shinozaki and Shinozaki, 1993)，在之后的研究中陆续报道了许多干旱诱导型启动子，包括水稻 OsNAC6 基因的启动子 POsNAC6 (Nakashima et al., 2007)、水稻 OsHATs 基因的启动子(Fang et al., 2014)、水稻 OsDhn1 基因的启动子(Lee et al., 2013)、水稻 Oshox24 基因的启动子 Oshox24P (杨梅和熊立仲, 2011)、硬质小麦 TdHDZipI-3 基因的启动子 HDZI-3 与 TdHDZipI-4 基因的启动子 HDZI-4 (Yang et al., 2020)、硬质小麦 TdP1P2;1 基因的启动子(Ayadi et al., 2014)、拟南芥 AtNCED3 基因的启动子(Behnam et al., 2013)、柑橘 Cu-Lea5 基因的启动子(Kim et al., 2011)和棉花 PGHSP26 基因的启动子(Zahur et al., 2009)等。接下来，小远主要给大家介绍一下 POsNAC6 和 HDZI-3、HDZI-4 启动子的应用案例。
3.3.1 POsNAC6
缺水是水稻生产的一个限制因素(Manavalan et al., 2012)，据估计，仅干旱这一项影响因素每年就会使全球水稻产量减少1800万吨(O’Toole, 2004)，因此培育抗旱水稻有助于减少缺水对水稻生产的影响。然而，在作物育种中抗性的提高和产量的提升往往难以兼顾，因此在保证作物产量的前提下提高其抗性是一项长期的挑战。
2020年8月，哥伦比亚国际热带农业中心Michael Gomez Selvaraj课题组在 Plant Biotechnology Journal 杂志上发表了一篇题为“Expression of the CCCH-tandem zinc finger protein gene OsTZF5 under a stress-inducible promoter mitigates the effect of drought stress on rice grain yield under field conditions”的研究论文，作者为了避免组成型表达 OsTZF5 对水稻造成的生长迟缓、生物量较低和结籽减少的影响，利用能够响应干旱胁迫的 POsNAC6 启动子来驱动 OsTZF5 的表达，并将其转化到NERICA4和Curinga这两种商业水稻品种中。通过测试农艺性状指标发现，在正常生长条件下，转基因水稻和对照没有明显的生长差别，但是在干旱条件下，NERICA4和Curinga这两个品种的转基因水稻有一部分株系与对照相比，无论是单株产量还是单位面积的谷物产量均有所提升（图6-8）。
图6 在使用雨棚进行的MDSE-2013试验中，Curinga植株中表达的POsNAC6:OsTZF5改善了水稻的产量。
（a）干旱胁迫期间的AquaPro土壤湿度剖面图，线表示四个不同深度（20、40、60和80厘米）的土壤湿度，箭头表示干旱胁迫的安排和采样时间。（b）水稻的开花时间。（c）水稻的穗长。（d）Curinga转基因株系的单株产量。（e）拍摄的MDSE试验中水稻单株产量的照片，从左至右分别为NT、3135、3229、3474、3480、3507和3508。MDSE：管理干旱胁迫环境。
图7 大田干旱条件下过表达POsNAC6:OsTZF5对Curinga植株籽粒产量的影响(Selvaraj et al., 2020)。
（a）在使用雨棚进行的MDSE-2012、（b）MDSE-2014和（c）田间目标环境TE-2012-13试验中的单株谷物产量。（d）田间目标环境TE-2014-2015试验中单位面积的谷物产量。
图8 大田干旱条件下过表达POsNAC6:OsTZF5对NERICA4植株籽粒产量的影响(Selvaraj et al., 2020)。
（a）在使用雨棚进行的MDSE-2016试验中的单株产量。（b）田间目标环境TE 2015-2016试验中单位面积的谷物产量。
3.3.2 HDZI-3、HDZI-4
在强组成型启动子的控制下过表达DREB/CBF亚家族的许多转录因子，可通过调节胁迫响应下游基因来增强转基因植物的抗逆性，但是在正常生长条件下，这些基因的组成型过表达通常会导致严重的生长迟缓和/或产量下降(Agarwal et al., 2017)。因此，寻找和测试胁迫诱导型启动子以优化转基因表达水平是改善植物发育和产量的关键方法之一。
2020年3月，阿德莱德大学Maria Hrmova课题组在 Plant Biotechnology Journal 杂志上发表了一篇题为“DREB/CBF expression in wheat and barley using the stress-inducible promoters of HD-Zip I genes: impact on plant development, stress tolerance and yield”的研究论文，在该论文中作者通过使用从硬质小麦中克隆的诱导型启动子 HDZI-3 和 HDZI-4 ，调节两种DREB/CBF基因 TaDREB3 和 TaCBF5L 在转基因小麦和大麦中的表达来对植物的抗逆性进行研究。结果显示，启动子对干旱强度的敏感性差异取决于受体材料的干旱耐受水平。 TaDREB3 基因的胁迫诱导表达提高了转基因大麦的耐旱性（图9），并且大部分T1代转基因植株表现出与对照相似的高度、分蘖数量、开花时间和产量。此外，在开花期间处于严重干旱条件时，由 HDZI-4 启动子驱动 TaCBF5L 基因表达的T4代转基因小麦产量大幅增加，相较野生型存在显著差异（图10）。
图9 在严重干旱条件下，野生型和T1代TaDREB3转基因大麦的存活率比较(Yang et al., 2020)。
图10 在严重干旱条件下，野生型和用pHDZI-3-TaCBF5L
（a）和pHDZI-4-TaCBF5L（b）转化的转基因小麦的表型数据(Yang et al., 2020)
小远叨叨
文章至此就先告一段落了，在本次推文中，小远虽然给大家罗列了许多病原菌诱导型启动子、害虫诱导型启动子和干旱诱导型启动子，但因为篇幅所限，对每一类诱导型启动子只介绍了1-2个比较有代表性的应用案例，大家如果对哪些启动子比较感兴趣的话也可以继续查阅相关资料进行学习哦。关于植物高温诱导型启动子、冷冻诱导型启动子、光诱导型启动子、激素诱导型启动子、盐诱导型启动子等的介绍，小远会继续搜集相关资料，在之后的公众号文章中陆续与大家分享，当然也欢迎大家留言自己感兴趣的诱导型启动子，小远会优先安排写作哦！宠粉，小远是认真的~
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