编译：肿瘤资讯编辑部来源：肿瘤资讯
既往的研究提示，染色质组织方式对癌细胞中的区域性突变率具有重大影响。近期发布在《Lancet Oncology》的一项研究通过采用“Nucleotyping”的方法评估肿瘤细胞核染色质的异质性，发现其染色质的异质性可以预测患者的预后。
背景
肿瘤细胞中基因有多种变异形式，从单核苷酸变异、基因扩增、基因重排到整条染色体的增多或减少。在很多常见瘤种中，染色体数目的异常与更差的预后相关。高级别的染色体结构调节基因的表达和细胞分化过程中基因表达的变化，提示染色体的重构可能参与疾病的发生。染色质组织方式同样对癌细胞中区域性突变率具有重大的影响。因此，整合分析染色质结构和DNA的密度可以客观评估基因的不稳定性和表观遗传学变异。
DNA的组织方式可以通过对细胞核中DNA的染色来进行描述，异常的组织结构预示着癌症的预后更差。在既往对染色质变异的评估中，采用机器学习算法（machine learning algorithms），以某一特定类型癌症队列中的一部分患者作为训练集，其余患者作为验证集。在这些研究中，用于分析的组织样本都是采用同样的方法准备并成像，因此，大大限制了这一分析方法的应用范围。对于其他队列的样本，如果没有采用同样的方法进行准备，可能就不适用。我们既往的研究结果提示，在卵巢癌，子宫癌，前列腺癌和子宫内膜癌均观察到相似的染色质组织方式变异，提示这一变异可能参与了癌症发病。因此，我们假设在大多数的瘤种中可以找到相似的染色质变异方式，即使标本的准备方式和成像设备不同，也可以被可靠的检测到。在本研究中，我们开发了一个自动分析方法，可以可靠的发现这一变异形式，称为“Nucleotyping”，且这一方法能够在多个瘤种内准确的验证。
方法
1. 研究队列
研究纳入了1993年到2003年，在Aker University医院进行手术的494例原发性I-II期的结直肠癌患者，其中390例患者最终纳入我们的训练集，入组流程图见下图1。其中 2例（<1%）患者接受了辅助化疗，324例（83%）患者没有接受辅助化疗，其余64例（16%）患者的信息缺失。118例直肠癌患者中均接受了全直肠系膜切除术，10例（8%）直肠癌患者接受了新辅助化疗。272例结肠癌患者均未接受新辅助治疗。研究同时纳入了6个验证队列，分别为队列B（英国格洛斯特结直肠癌验证队列，纳入442例患者），队列C（QUASAR 2结直肠癌验证队列，纳入391例患者），队列D（卵巢癌队列，纳入246例I期卵巢癌患者），队列E（子宫肉瘤队列，纳入354例患者），队列F（前列腺癌队列，纳入307例患者），队列G（纳入791例子宫内膜癌患者）。
图1. 入组流程图
2. 样本准备、成像和核型结构分析
子宫内膜癌患者的细胞核图片取自子宫内膜刮宫活检标本，其余肿瘤患者均取自手术切除标本。病理医生选取一个有代表性的肿瘤区域进行取材，对于前列腺癌专注，考虑到肿瘤的异质性，选取3-4个区域取材。切取1张或数张50um的切片，采用改良的Hedley法来获取分离核。具体的核型结构分析总结见下图2. 通过对训练集标本进行分析，研究者定义只有相对小部分的细胞核（训练集中为36%）表现为高级别的染色质模式，则肿瘤的染色质为异质性的；而一个染色质同质性的肿瘤，则有相对大部分的细胞核（训练集中为57%）染色质模式表现为轻度异常的组织形式。
图2. 核型结构分析
结果
1. 染色质异质性与癌症特异性生存的关系
在结直肠癌训练集中（n=390），155例（40%）为染色质异质性的肿瘤，235例（60%）为染色质同质性的肿瘤。染色质异质性的肿瘤相比于染色质同质性的肿瘤，癌症特异性生存更短，无论是多因素分析还是单因素分析，均观察到相似的结果，多因素分析结果见下图3A。进一步进行敏感性分析，如在多因素分析模型中考虑到左右半的位置，或去除接受新辅助治疗或辅助治疗的患者。在II期结直肠癌中，染色质同质性肿瘤共164例，5年癌症特异性生存率为83%（95%CI：76-88）；而染色质异质性肿瘤114例，5年癌症特异性生存率为72%（95%CI：62-79）。
在英国格洛斯特结直肠癌验证队列中，308例（70%）为染色质异质性肿瘤，134例（30%）为染色质异质性肿瘤，对这两组患者进行比较，进一步验证了训练集的结果，癌症特异性生存比较见下图3B。在II期结直肠癌中，染色质同质性肿瘤共254例，5年癌症特异性生存率为85%（95%CI：78-89）；而染色质异质性肿瘤105例，5年癌症特异性生存率为72%（95%CI：59-81）。队列C为QUASAR 2结直肠癌验证队列，分别有244例（62%）为染色质异质性肿瘤，147例（38%）为染色质异质性肿瘤。染色质异质性肿瘤的患者，癌症特异性生存更短（多因素分析HR=2.6，95%CI：1.2-5.6，见下图3C）。
图3. 染色质同质性和染色质异质性的肿瘤癌症特异性生存比较，A代表训练集，B-G分别代表6个验证集。
进一步汇总分析3个结直肠癌队列，染色质异质性状态与患者性别，疾病分期（II vs I），肿瘤原发灶病理分期（T4 vs T3 vs T2 vs T1）无关，也与结肠癌或直肠癌无关，仅与肿瘤左右半的位置弱相关。此外，还与患者的年龄，组织学分级，微卫星不稳定性和手术类型弱相关。单独纳入II期结直肠癌进行分析，结果显示，染色质异质性肿瘤和同质性肿瘤之间的HR值在各个亚组患者中相似，见下图5.
图4. 所有II期结直肠癌患者，染色质异质性状态与癌症特异性生存的森林图
2. 结直肠癌患者中，染色质异质性状态与微卫星稳定性状态与预后的关系
染色质异质性相比于微卫星稳定性状态（稳定 vs 不稳定），能够更精准的预测II期结直肠癌的预后，见下图5. 在多因素分析模型中，纳入微卫星稳定性状态进行分析，癌症的特异性生存在染色质异质性的肿瘤中更短（相比于染色质同质性的肿瘤，HR=1.9；95%CI：1.3-2.8）。
图5. 根据Nucleotyping分型和微卫星稳定性状态来分析II期结直肠癌患者的癌症特异性生存：5A. Nucleotyping分型（染色质异质性和同质性）；5B. 微卫星稳定性；5C.微卫星不稳定肿瘤中的Nucleotyping分型；5D. 染色质同质性肿瘤中的微卫星不稳定性状态；5E. 微卫星稳定肿瘤中的Nucleotyping分型；5F. 染色质异质性肿瘤中的微卫星不稳定性状态。
3. 其余4个瘤种队列中的验证
在卵巢癌队列中（队列D），77例（31%）为染色质异质性肿瘤，169例（71%）为染色质同质性肿瘤。染色质异质性肿瘤的患者，癌症特异性生存显著更短（见图3D）。染色质同质性肿瘤和异质性肿瘤，5年癌症特异性色号给你存率分别为88%（95%CI：82-92）和68%（95%CI：56-77）。
在354例子宫肉瘤队列中（队列E），201例（57%）为染色质同质性肿瘤，153例（43%）为染色质异质性肿瘤，染色质异质性同样能预测患者的5年癌症特意性生存率（见图3E）。染色质同质性肿瘤和异质性肿瘤，5年癌症特异性生存率分别为67%（95%CI：61-74）和35%（95%CI：28-43）。
在307例前列腺癌（队列F），55例（18%）为染色质异质性肿瘤，其余252例（82%）为染色质同质性肿瘤。在单因素分析中，癌症特异性生存在染色质异质性肿瘤中显著更短，而多因素分析中，两组差异无统计学意义，见图3F。5年癌症特异性生存率同质性肿瘤和异质性肿瘤分别为99%（95%CI：96-100）和94%（95%CI：83-98）。
在子宫内膜癌队列（队列G）中，791例患者，118例（15%）为染色质同质性肿瘤，其余673例（85%）为染色质异质性肿瘤。染色质异质性肿瘤患者有显著更短的癌症特异性生存（图3G），两组患者5年癌症特异性生存率分别为62%（95%CI：49-72）和90%（95%CI：86-92）。
结论和讨论
本研究纳入6个独立的验证队列，覆盖不同的瘤种，与训练集的结果相似，染色质的异质性均与癌症特异性生存相关。这一研究结果提示，染色质的异质性可能是一个新的预后指标，无论肿瘤的组织学起源，在传统TNM分期的基础上增加一个新的癌症预后指标。研究者采用Nucleotyping的方法在不同生物学类型和不同技术背景下，均显示出染色质异质性可以很好的预测肿瘤的预后，提示这一方法在常规临床实践中可以可靠的评估，并用于辅助制定临床治疗决策。如发现高风险的II期结直肠癌患者，这类患者可能可以从辅助化疗中获得更大的获益。未来，需要单独进行临床研究，以探索Nucleotyping用于指导临床治疗决策能否真正带来患者的生存获益。
参考文献
Chromatin organisation and cancer prognosis: a pan-cancer study. Lancet Oncol 2018 Published Online February 2, 2018.
http://dx.doi.org/10.1016/S1470-2045(17)30899-9
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