再次体验一下TBtools的强大。使用TBtools对基因家族进行分析，进化树、Motifs 、结构域和基因结构多图合一。

一、数据准备

1.基因组组装结果fasta格式

2.基因组注释结果gff3格式

3.模式物种或近缘物种的基因家族的蛋白序列fasta格式

二、软件

1.TBtools （https://github.com/CJ-Chen/TBtools）

2. MEME (https://meme-suite.org/meme/tools/meme)

3.Batch CD-Search （https://www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/bwrpsb/bwrpsb.cgi）

4.MEGA (https://megasoftware.net/)

三、实战操作

示例选用了P450基因家族进行分析。

1.*载下**已知物种的基因家族蛋白序列

在数据库中*载下**了意大利蜂的Cytochrome P450 9e2基因家族序列的蛋白序列。

2.提取目标物种蛋白序列

TBtools中GXF Sequences Extract插件输入目标物种gff文件和基因组fa文件，设置输出cds.fa

TBtools中 Batch Translate CDS to Protein 将提取到的核酸序列翻译成氨基酸序列。

得到蛋白质序列

3.多序列比对

TBtools中 Blast Several Sequnences to a Big Database, 输入意大利峰P450蛋白序列，和提取到目标物种的蛋白序列。设置E值等。

输出结果

复制比对上的gene名，下一步根据这些gene名提取目标物种的P450蛋白序列。

4.提取目标物种的P450基因家族所有蛋白序列

TBtools中Fasta Extract，输入目标物种所以蛋白fasta文件和P450基因名，设置输出结果。

得到目标物种的P450基因家族的序列就完成了很重要的一步，接下来可以进行基因家族分析。

5.基因家族Motif分析

首先打开MEME网页进行在线分析，设置输入P450基因家族蛋白序列点击提交。

上传数据后会自动识别为Protein，可以设置希望发现的motif数量，这里设置为10，最后点击提交。

在输出结果中点击MAST XML output*载下**。接下来在TBtools中进行可视化。

设置输入文件mast.xml，可视化结果如下。

6.基因家族保守结构域分析

首先打开NCBI的Batch CDD 网页进行在线分析，设置输入P450基因家族蛋白序列点击提交。

*载下**结果文件，为txt格式，可以根据需要选择。之后在TBtools中可视化。

在设置输入*载下**的txt文件和P450蛋白序列文件，点击开始得到以上结果。

7.基因结构分析

TBtools中 Visualize Gene Structure完成, 基因组注释gff文件和P450基因名。

得到基因结构的结果。

8.基因家族进化分析

接下来通过MEGA构建一个简单的基因树，输入数据为目标物种P450基因家族的蛋白质序列。

先进行多序列比对，用MUSCLE默认参数。

将比对好的结果保存为.meg格式。

重新打开比对后的文件，构建进化树，使用最大似然法，根据需要选择建树方法。再构建之前可以进行模型的预测，这里节省时间直接使用默认参数。

现在就构建好了一棵进化树，导出为.nwk格式。接下来最后一步就是再TBtools中展示所有结果。

9.展示所有结果

TBtools中 Gene Structure View （Advanced）, 共输入4个文件，从上到下，第一个进化树的.nwk格式文件，第二个MEME结果文件.xml格式，第三个基因组注释文件。gff格式，第四个Batch-CDD结果文件（这个需要手动修改，第一列基因名，第二列，起始位置，第三列终止位置，第四列蛋白质结构域）。

这样基因家族进行分析，进化树、Motifs 、结构域和基因结构的一张图就画好了。

总的来说TBtools进行基因家族分析还是非常方便的，图形界面的操作用文字描述有些不便学习操作，大家可以参考陈老师b站中的教学视频CJchen-0410。

以上内容仅为个人总结，如有错误之处敬请批评！

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