文：远笙纪

编辑：远笙纪

黄瓜是中国最常种植和消费的蔬菜作物之一。然而，黄瓜在生长发育过程中常常受到高盐、干旱等非生物逆境，以及*粉白**病等生物逆境的威胁，严重影响了产量和品质。

因此，发现与黄瓜逆境胁迫相关的关键调控基因不仅能揭示抗性的分子遗传机制，还能加速黄瓜抗性育种的进程。

有研究发现，丝氨酸羧肽酶类（SCPL）蛋白是一类广泛存在于高等植物中的蛋白质，其代表结构域为PF00450。

SCPL蛋白在结构和功能上与丝氨酸羧肽酶（SCP）相似，属于SC羧肽酶中的S10家族。它们具有相似的α/β水解酶三级结构，包括独特催化中心、拓扑结构高度保守的区域。

SCPL蛋白通常含有细胞内分泌和转运的信号肽、底物结合位点、N-糖基化位点以及与催化作用相关的进化保守区域。

虽然SCPL蛋白与SCP蛋白在结构上有一些差异，但它们的功能相似，普遍具有肽酶活性，部分SCPL蛋白还具有酰基转移酶活性。

SCPL蛋白主要分布在植物的液泡、溶酶体等部位，在细胞伸长、种子发育等生长发育过程中发挥重要作用。例如，水稻中的GS5基因是控制籽粒大小和产量的一个正调控因子，其差异表达引起了籽粒大小的变化。

类似地，在提莫菲维小麦中，GS5的同源蛋白可能通过与膜联蛋白Annexin D1的互作调控籽粒大小。

已有研究表明，SCPL蛋白还参与很多次生代谢产物的合成，并在植物的生物和非生物逆境响应中发挥重要作用。

尽管已经对SCPL蛋白在其他植物中的功能进行了研究，但在黄瓜中相关研究尚未见报道。

因此，本研究通过生物信息学方法，在黄瓜基因组数据中检索了SCPL基因，并分析了这些基因的染色体定位、序列特征、进化关系以及在不同组织和胁迫条件下的表达谱。

这些研究结果为进一步了解黄瓜SCPL蛋白的功能提供了理论基础。

黄瓜SCPL家族成员的鉴定

登录PFAM数据库并使用PF00450号登录号*载下**SCPL基因的隐形马尔科夫模型文件。

使用HMMER v3.0软件中的SCPL家族的HMM配置文件，对黄瓜Chinese Long v2版本蛋白数据库进行扫描。

在黄瓜Chinese Long v2基因组网站上以拟南芥SCPL蛋白作为查询序列进行BLAST。

整合HMMER和BLAST的结果，去掉长度低于200个氨基酸的蛋白序列。

对剩余的候选蛋白序列利用PFAM和SMART网站进行验证。

最后，具有PF00450特征结构域的蛋白序列被鉴定为黄瓜SCPL基因家族成员。

黄瓜SCPL蛋白理化性质分析方法如下：

从黄瓜Chinese Long v2基因组数据库中*载下**黄瓜SCPL基因的编码蛋白序列。

使用ExPASy服务器中的ProtParam工具预测每个黄瓜SCPL蛋白的氨基酸数目、分子量、等电点以及亲疏水性均值（GRAVY）。

利用Plant-mPLoc程序对黄瓜SCPL蛋白进行亚细胞定位预测。

黄瓜SCPL家族成员系统发育及基因结构分析方法如下：

从TAIR数据库中*载下**拟南芥SCPL基因家族成员的蛋白序列。

将拟南芥和黄瓜SCPL蛋白序列在MAFFT网站进行比对。

导入MEGA 7.0软件中，采用邻接法对SCPL蛋白构建系统发育树，校验参数Bootstrap值设置为1,000。

从黄瓜基因组数据库中*载下**黄瓜SCPL基因的CDS及gDNA序列，利用Gene Structure Display Server（GSDS）软件对SCPL基因结构进行可视化分析。

基于转录组的黄瓜SCPL基因表达分析方法如下：

我们从NCBI的SRA数据库中*载下**黄瓜根、茎、叶、花、子房和卷须等组织的RNA-seq数据，分析SCPL基因的组织表达模式。

从NCBI数据库中*载下**黄瓜叶和根的盐胁迫基因表达数据，分析黄瓜SCPL基因在盐胁迫下的表达谱，登录号分别为GSE116265和PRJNA511946。

从NCBI数据库中*载下**高抗*粉白**病且能稳定遗传的片段代换系和高感*粉白**病受体亲本，在接种*粉白**病菌48小时后的转录组数据分析。

黄瓜SCPL家族的鉴定及蛋白理化性质分析

根据使用HMMER软件进行筛选和功能域验证的结果，研究人员在黄瓜基因组中鉴定出了27个属于SCPL家族的基因。

根据这些基因在染色体上的位置信息，它们被命名为CsaSCPL1~CsaSCPL27（见表1）。这些基因分布在黄瓜的7条染色体上。

其中，1号和3号染色体上含有最多数量的CsaSCPL基因（各6个），4号染色体上有5个基因，7号染色体上有4个基因，而2号、5号和6号染色体上含有最少数量的CsaSCPL基因（各2个）。

通过对这些蛋白的理化性质进行分析，研究人员发现黄瓜SCPL蛋白的分子量在24.40千道尔顿到88.75 ku之间不等。这些蛋白的等电点pI值在5.01到9.20的范围内。

根据GRAVY值的预测结果，除了CsaSCPL14之外，黄瓜SCPL蛋白几乎都是亲水性蛋白。通过亚细胞定位的预测结果显示，大多数CsaSCPL蛋白定位于液泡，少量定位于过氧化物酶体和胞外。

表1 黄瓜SCPL家族成员基本信息

黄瓜SCPL家族成员系统进化分析

为了揭示黄瓜SCPL基因的系统进化关系，我们选择了拟南芥和黄瓜的全部SCPL蛋白质序列，构建了系统进化树，结果如图1所示。

根据进化树的分支，CsaSCPL（黄瓜）和AtSCPL（拟南芥）家族成员可以分为3组：SCPL-I、SCPL-II、SCPL-III。

在黄瓜中，CsaSCPL成员在SCPL-I组中最为丰富，共有17个成员；而在SCPL-II和SCPL-III组中，成员数量较少，各有5个。

图1 黄瓜与拟南芥SCPL家族成员系统进化分析

黄瓜SCPL蛋白保守基序分析

我们利用MEME在线软件构建了黄瓜保守基序的结构特征图（图2），结果显示CsaSCPL蛋白均含有典型的保守基序Motif 1。

在SCPL-I组中的大多数CsaSCPL蛋白（除了CsaSCPL1、CsaSCPL12、CsaSCPL13、CsaSCPL14）都含有Motif 1-10，并且Motif的相对位置也比较保守。相比之下，SCPL-II和SCPL-III组中的大部分CsaSCPL蛋白含有较少种类的保守基序。

例如，CsaSCPL6缺少Motif 1~4，CsaSCPL17缺少Motif 2、Motif 9和Motif 10。结合进化树的分析结果可以发现，CsaSCPL蛋白的保守基序特征与进化树的关系基本一致。

值得注意的是，CsaSCPL21（SCPL-I组）和CsaSCPL18（SCPL-II组）的蛋白序列分别出现了Motif 6和Motif 8的复制，而且这些复制都出现在对应蛋白的N端（图2）。

图2 黄瓜SCPL家族成员系统进化及蛋白质保守基序分析

黄瓜SCPL基因外显子-内含子结构分析

通过分析CsaSCPL基因的外显子-内含子结构，本研究得到的结果如图3所示。除了CsaSCPL20以外，其他CsaSCPL基因都含有3到13个数量不等的内含子。

图3 黄瓜SCPL家族成员系统进化及基因结构分析

进一步结合进化树的分析，发现SCPL-II组和SCPL-III组中的CsaSCPL成员（除了CsaSCPL20）普遍具有较多的内含子（8到13个），而SCPL-I组中的CsaSCPL成员的内含子数量为3到9个。

此外，亲缘关系较近的CsaSCPL基因普遍具有相似的外显子-内含子结构，尽管存在一些内含子长度的变化。这些结果进一步支持了CsaSCPL基因的分类。

黄瓜SCPL基因在不同组织中的表达模式

在本研究中，我们从NCBI数据库中*载下**了CsaSCPL基因家族的各成员在不同组织中的表达情况，并利用TBtools软件的热图工具展示了结果（图4）。为了更好地比较和显示数据，对表达量进行了对数转换。

图4 黄瓜CsaSCPL基因组织表达谱

结果显示，CsaSCPL1和CsaSCPL10在叶和根中表达具有明显的组织特异性，这表明它们在叶和根的发育过程中可能具有重要的功能。

此外，CsaSCPL2、CsaSCPL4、CsaSCPL5、CsaSCPL9、CsaSCPL15、CsaSCPL16、CsaSCPL18、CsaSCPL22和CsaSCPL26在雌花和雄花上的表达差异显著，暗示它们可能在花的发育中发挥重要的作用。

另外，CsaSCPL2、CsaSCPL4、CsaSCPL5、CsaSCPL11、CsaSCPL19、CsaSCPL26和CsaSCPL27在黄瓜子房发育的不同阶段表达存在明显的差异，这表明它们可能参与了黄瓜子房的发育过程。

黄瓜SCPL基因在盐胁迫下的表达模式

结合前人对盐胁迫表达转录组测序数据的研究，本研究获得了黄瓜SCPL基因在盐胁迫条件下的表达量数据（图5）。

图5 黄瓜SCPL家族基因在盐胁迫下的表达模式

结果显示，在盐胁迫处理的叶片中，CsaSCPL2、CsaSCPL11和CsaSCPL19的表达量明显上升，而CsaSCPL1的表达量则明显下降，其余基因的表达量没有明显的差异。

在盐胁迫处理的根中，CsaSCPL11的表达量明显上升，而CsaSCPL2、CsaSCPL16和CsaSCPL18的表达量明显下降。这些结果表明这些CsaSCPL基因可能参与了黄瓜在盐胁迫条件下的响应过程。

图6 黄瓜SCPL家族基因在D8和SSL508-28中*粉白**病菌响应分析

黄瓜SCPL基因在*粉白**病胁迫下的表达分析

为了揭示CsaSCPL基因在黄瓜抗*粉白**病中的功能，本研究利用高通量转录组测序数据分析了黄瓜SCPL家族基因在D8和SSL508-28接种*粉白**病菌前后的表达模式。

结果显示，在D8（高感*粉白**病受体亲本）接种*粉白**病菌后，CsaSCPL2、CsaSCPL4、CsaSCPL9、CsaSCPL11、CsaSCPL15、CsaSCPL24、CsaSCPL27的表达量明显上升，而CsaSCPL1的表达量则明显下降（图6）。

相比之下，在SSL508-28（高抗*粉白**病且能稳定遗传的片段代换系）接种*粉白**病菌后，只有CsaSCPL15的表达量明显上升，其余基因的表达量没有明显的变化（图6）。

这些结果揭示了CsaSCPL基因在黄瓜抵抗*粉白**病过程中的表达调控模式的差异。

根据前人研究，*粉白**病是黄瓜的常见病害之一，而D8和SSL508-28分别代表了*粉白**病高感亲本和高抗片段代换系，具有不同的抗性水平。因此，CsaSCPL基因在这两个品种中的表达差异可能与它们对*粉白**病的抗性有关。

结论与讨论

本研究利用生物信息学的方法对黄瓜SCPL基因家族进行了测定。黄瓜是一种重要的农作物，SCPL基因在黄瓜的种子萌发、细胞程序性死亡、次生代谢产物的合成以及抵抗逆境胁迫等过程中发挥重要作用。

通过全基因组水平的研究，我们在黄瓜中鉴定到了27个CsaSCPL基因，这些基因分布在黄瓜的7条染色体上。

与其他物种相比，不同物种内SCPL基因家族成员的数量差异较大。比如拟南芥、水稻、杨树、茶树、小麦中分别鉴定到的SCPL基因数量分别为54、71、57、47、210个，而这些物种中SCPL基因的数量并不取决于其基因组的大小。

因此，SCPL基因数量的变化可能主要与基因复制事件有关。本研究发现黄瓜相对较少的CsaSCPL基因可能是由于在进化过程中发生了较少的染色体复制事件。

在拟南芥中有一些基因仅在衰老的叶片、根、花和幼苗中表达，在根、衰老的叶片、幼苗、花、角果中具有最高的表达量。

在茶树中，也有一些基因只在顶芽、幼叶和茎中表达。水稻中的GS5基因在绿色组织中的表达量高于非绿色组织，并且在长度为1-11 cm的幼穗中表达量最高。

本研究检测了黄瓜SCPL基因的组织表达模式，并发现CsaSCPL基因的表达量也具有组织特异性。

为了了解黄瓜SCPL基因家族对逆境胁迫的反应，我们分析了CsaSCPL基因在盐胁迫和*粉白**病菌侵染条件下的表达量变化。

结果显示，在盐胁迫处理下，一些CsaSCPL基因的表达量发生明显变化，提示它们可能参与调控黄瓜植株的耐盐性。

此外，CsaSCPL15在黄瓜抵御*粉白**病侵染过程中表达量显著上升，尤其在抗性株系中表达量更高，表明CsaSCPL15在黄瓜抵御*粉白**病的过程中发挥重要功能。