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文 |不会飞的呆瓜

编辑 |不会飞的呆瓜

前言

拉曼散射光谱是一种针对分子极化率发生变化的振动而出现的一种检测手段，与红外光谱不同，这种方法具有耗样量少、检测速度快、谱图容易识别等特点，被广泛的应用于催化以及医学领域，表面增强拉曼光谱是拉曼散射光谱应用中的一种。

在测试吸附在粗糙银电极表面的吡啶时发现此时吸附在电极上的吡啶的拉曼信号比溶液中吡啶的拉曼信号要高出6个数量级，由此第一次定义了表面增强拉曼效应（SERS），目前表面增强拉曼光谱已经普遍被应用于生物检测以及免疫传感器的构建。

锐钛矿型介孔二氧化钛因其独特的晶格结构与其多孔洞的形貌特点，与一般材料相比，比表面积比较大。

有人根据不同类型的硬模板剂制备出的介孔二氧化钛材料比表面积可达130m2/g，孔容积可达0.97cm3/g，大的比表面积导致材料本身具有很强的吸附性，能够与其他纳米粒子稳固的结合在一起。

此外锐钛矿型二氧化钛本身良好的光学性能和表面形貌使其在光学检测领域有着广泛的应用。

有报道指出Au@Ag核壳结构纳米粒子中的金核能够通过电荷转移的方式对外部的银原子产生很强的电子效应，使得银原子的活性大大提高，甚至高于单质银原子的活性，广泛的应用于光催化、生物检测等领域。

对巯基苯甲酸本身带有一个苯环，在拉曼光谱中苯环的特征峰具有杂峰少，峰强度高等特点，适合用于定量检测，有人利用对巯基苯甲酸构建免疫传感器用于检测IgG抗原，检出限低至700pM。

利用Au@Ag与介孔二氧化钛协同增强对巯基苯甲酸拉曼光谱信号的原理，构建了以TiO2/Au@Ag/4-MBA为拉曼信标分子的拉曼免疫传感器，并用于检测甲胎蛋白（AFP），与TiO2/Ag/4-MBA相比，TiO2/Au@Ag/4-MBA的拉曼信号强度更强，灵敏度更高，应用潜力更广泛。

仪器与试剂

钛酸四丁酯（TBOT，98%，上海润洁化学试剂有限公司），牛血清蛋白（BSA，上海阿拉丁试剂有限公司），N-羟基丁二酰亚胺（NHS）（上海阿拉丁试剂有限公司），1-乙基（-3-二甲基氨基丙基电场增强效应和电子配体效应能够使其与介孔二氧化钛共同协同增强对巯基苯。

甲酸中苯环的拉曼信号。利用拉曼信标分子表面的羧基，将其标记到甲胎蛋白（AFP）二抗表面。固载在磁性微球表面的甲胎蛋白（AFP）一抗、甲胎蛋白抗原、标记有拉曼信标分子的甲胎蛋白（AFP）二抗形成“三明治”夹心型结构，结合磁性分离技术实现了甲胎蛋白（AFP）的定量检测。

线性范围是0.001ng/mL~0.4ng/mL，检测限低至0.0005ng/mL。由于介孔二氧化钛与银纳米复合材料协同增强拉曼信号的原因，该检测方法具有信号值高，灵敏度强的优点。与此同时，该检测方法材料制备简单，原料易于获得。为该方法的广泛应用提供了便利。

三嵌段共聚物（P123）（北京百灵威科技有限公司），甲胎蛋白（AFP）（北京博奥森生物技术有限公司），甲胎蛋白抗体（北京博奥森生物技术有限公司），甲胎蛋白定量测试试剂盒（郑州博赛生物技术股份有限公司）。

单分散聚乙烯微球（-COOH，1-2µm，天津倍思乐色谱技术开发中心），4-巯基苯甲酸（C7H6O2S，99%，百灵威化学技术有限公司），氯金酸（HAuCl4·4H2O，99.9%百灵威化学技术有限公司）。

柠檬酸钠（C6H5Na3O7·2H2O，99.0%，天津市鼎盛鑫化工有限公司），硝酸银（AgNO3，99.8%，上海化学试剂有限公司），硼氢化钠（99.9%，上海阿拉丁试剂有限公司），β-环糊精（上海阿拉丁试剂有限公司），试验中均采用二次蒸馏水配制试剂。

拉曼光谱仪（英国inViaRamanMicroscope），紫外分光光度计（Cary50，美国瓦里安公司），扫描电子显微镜（JSM-6700F），透射电子显微镜（JEM-2100）。

按照文中制备金银核壳纳米粒子的方法，准确称取0.040gβ-环糊精，加入5mL二次蒸馏水，搅拌至β-环糊精完全溶解，量取77μL氯金酸溶液（1%）加入到反应体系中，搅拌2min后加入50μL氢氧化钠溶液（1M）调节pH。

加热搅拌至90℃并保持15min，最后向体系中加入32μL硝酸银溶液（1%），继续搅拌1h，冷至室温避光保存备用，所制备纳米粒子的Au:Ag比例为1:1。

制备金银核壳纳米粒子的方法，准确称取0.040gβ-环糊精，加入5mL二次蒸馏水，搅拌至β-环糊精完全溶解，量取51μL氯金酸溶液（1%）加入到反应体系中，搅拌2min后再加入50μL氢氧化钠溶液（1M）调节pH。

加热搅拌至90℃并保持15min，最后向体系中加入43μL硝酸银溶液（1%），继续搅拌1h，冷至室温避光保存备用，所制备纳米粒子的Au:Ag比例为1:2。

制备金银核壳纳米粒子的另外一种方法，准确称取0.040gβ-环糊精，加入5mL二次蒸馏水，搅拌至β-环糊精完全溶解，量取39μL氯金酸溶液（1%）加入到反应体系中，搅拌2min后再加入50μL氢氧化钠溶液（1M）调节pH。

加热搅拌至90℃并保持15min，最后向体系中加入48μL硝酸银溶液（1%），继续搅拌1h，冷至室温避光保存备用，所制备纳米粒子的Au:Ag比例为1:3。

称取5.0mL的钛酸四丁酯（TBOT），滴加到20mL无水乙醇中，30℃快速搅拌1h得到（1）溶液，另取40mL乙醇并加入一定量的盐酸，置于40℃下搅拌30min得到（2）溶液。

缓慢的将（1）溶液和（2）溶液混合并置于室温下搅拌3h得到（3）溶液，称取一定量的三嵌段共聚物（P123）溶解到10mL乙醇中，充分搅拌30min得到（4）溶液，最后，将（3）溶液分散到（4）溶液中加热搅拌1h得到透明二氧化钛溶胶。

取一干净培养皿用于盛放二氧化钛溶胶，先将胶体置于40℃条件下，挥发溶剂，然后在60℃条件下陈化24h，最后置于箱式电阻炉中灼烧2h得到纳米介孔二氧化钛。

取0.05g介孔二氧化钛，加入15mL无水乙醇和5mL二次蒸馏水，搅拌30min后向体系中加入10mL步骤3.2.2制备的金壳银核材料，加热搅拌1h，加入0.5g对巯基苯甲酸，保持150℃搅拌1h，离心干燥备用。

称取0.001g步骤3.2.4制备好的拉曼信标分子材料，加入100μLN-羟基丁二酰亚胺（NHS，0.2M）和100μL1-乙基-（3-二甲基氨基丙基）碳二亚胺盐酸盐（EDC，0.8M）置于恒温振荡器中37℃下震荡1h，离心洗涤三次后得到沉淀物。

向沉淀物中加入100μL甲胎蛋白（AFP）二抗（20μg/mL），置于恒温震荡器中，在37℃下震荡24h，用PBS缓冲溶液洗涤三次，即为拉曼信标分子标记的AFP二抗。

量取50μL羧基修饰的单分散聚乙烯微球（1-2µm），并用咪唑-盐酸（0.1M，pH=7.4）洗涤三次，磁性分离后加入100μLN-羟基丁二酰亚胺（NHS，0.2M）和100μL1-乙基-（3-二甲基氨基丙基）碳二亚胺盐酸盐（EDC，0.8M）至于恒温振荡器中37℃下震荡1h，磁性分离多次。

加入400μLPBS缓冲溶液（pH=7.4）定容，然后加入100μL甲胎蛋白（AFP）一抗（20μg/mL），置于恒温震荡器中，在37℃下震荡24h，磁性分离后用PBS缓冲溶液洗涤三次并定容至400μL。

向上述400μL抗体包被的磁性微球中加入100μL1%的牛血清蛋白（BSA）溶液，放置在恒温震荡器中震荡1h用以封板。

用PBS缓冲溶液（pH=7.4）磁性分离洗涤三次，定容至400μL，加入100μL不同浓度的AFP抗原摇匀后置于恒温震荡器下震荡12h，磁性分离洗涤三次并分散到500μLPBS缓冲溶液（pH=7.4）中备用。

将上述500μL免疫磁性微球加入到之前制备的标记了拉曼信标分子的AFP二抗中混匀，置于震荡器中震荡12h，离心后用PBS缓冲溶液洗涤三次，最后重新分散到100μLPBS缓冲溶液，用于拉曼散射检测。

称取0.1g介孔二氧化钛，分散到20mL无水乙醇中，加热搅拌30min，向体系中加入20mLAu@Ag纳米粒子，搅拌1h后离心干燥，分别称取0.005g上述材料分散到无水乙醇中，加入0.001g、0.002g、0.004g、0.006g、0.008g、0.01g对巯基苯甲酸，加热搅拌1h后离心干燥，用于拉曼散射光谱检测。

取纯度为99.99%的Pt片，依次放入到无水乙醇溶液、*酮丙**溶液中超声15min，放置在恒温干燥箱中干燥备用。

取制备好的检测溶液0.8μL滴到处理好的Pt基底上，自然晾干后进行拉曼散射检测。

结果与讨论

Au@Ag纳米粒子表现出更强的SERS活性，这主要是因为双金属纳米粒子存在局域电场增强效应和电子配体效应，银包金纳米粒子内部的金原子能够通过电荷转移的方式对外部的银原子产生很强的电子效应，使得银原子的活性大大提高，甚至高于单质银原子的活性。

本实验采用对巯基苯甲酸修饰的负载介孔二氧化钛的银纳米粒子作为拉曼信标分子，由文中可知，S原子能与Ti原子形成Ti-S键，此外，S原子也可以与Ag原子结合形成Ag-S键。

通过Ti-S键和Ag-S键可以将对巯基苯甲酸修饰在复合材料（Ag/TiO2）表面，裸露出来的羧基经过EDC和NHS的活化后，能够与甲胎蛋白（AFP）二抗当中的氨基结合起来。

带有羧基修饰的磁性微球同样也可以在EDC和NHS的作用下与甲胎蛋白（AFP）一抗中的氨基结合起来，这两种被标记过的抗体与甲胎蛋白（AFP）抗原形成双抗夹心式的结构，甲胎蛋白（AFP）抗原的含量就和与二抗相结合的拉曼信标分子的含量有一定的比例关系。

当抗原含量越多时会有更多的拉曼信标分子通过二抗与抗原结合，所测得的拉曼信号值也就越高，从而实现对AFP抗原的定量检测，实验原理图如下图所示。

取一定量的Au@Ag纳米粒子，用于可见紫外光谱的检测，如下图所示，检测发现，当Au:Ag的量为1:1时在520nm左右出现了一个紫外吸收峰，这个峰是Au的特征峰，而检测不出Ag的吸收峰，这可能是由于包裹在金纳米颗粒表面的银粒子太少，吸收峰不明显而被金的吸收峰所掩盖导致的。

当Au:Ag的量为1:2时在400nm左右和520nm左右同时检测出两个紫外吸收峰，有文中可知400nm的吸收峰为Ag的特征吸收峰，520nm的吸收峰为Au的特征吸收峰。

当Au:Ag的量为1:3时在紫外可见光谱中能够检测出Ag的吸收峰而检测不出Au的吸收峰，这可能是由于金表面的银离子过多遮挡住了金纳米粒子的紫外光谱信号导致的，本实验采用Au:Ag比例为1:2的Au@Ag纳米材料制备拉曼信标分子。

如下图所示， 图A为金银核壳结构纳米粒子的透射电子显微镜图像，由图中可以看出制备的金银核壳结构纳米粒子分散性较好，粒径也比较均一，大概有20nm左右，图B为负载有介孔二氧化钛的金银核壳结构纳米粒子的透射电子显微镜图像，从图中可以看出介孔二氧化钛已经成功的负载到了金银核壳结构纳米粒子上。

取0.001g制备好的拉曼信标分子材料均匀的分散到100μLPBS缓冲溶液中，取1μL分散液滴到Pt片上，自然晾干后进行拉曼散射光谱检测。

如下图所示，从图中可以看出在1074cm-1和1580cm-1的位置上出现了明显的拉曼散射峰，这两个峰是芳香类化合物中苯环的特征峰，说明本文所采用的方法成功的将对巯基苯甲酸修饰在了介孔二氧化钛金银核壳复合材料上。

结论

本文首先制备出介孔二氧化钛与Au@Ag纳米结构粒子的复合材料，通过其与对巯基苯甲酸反应，将羧基引入到材料表面，同时双金属纳米粒子存在的局域电场增强效应和电子配体效应能够使其与介孔二氧化钛共同协同增强对巯基苯甲酸中苯环的拉曼信号。

利用拉曼信标分子表面的羧基，将其标记到甲胎蛋白（AFP）二抗表面，固载在磁性微球表面的甲胎蛋白（AFP）一抗、甲胎蛋白抗原、标记有拉曼信标分子的甲胎蛋白（AFP）二抗形成“三明治”夹心型结构，结合磁性分离技术实现了甲胎蛋白（AFP）的定量检测，线性范围是0.001ng/mL~0.4ng/mL，检测限低至0.0005ng/mL。