笔者从饲料原料中分离得到能够抑制大肠杆菌生长的乳酸菌，通过排除发酵液中有机酸和H2O2的干扰，初步确定4株具有较强抑菌功能的乳酸菌。分别采用胰蛋白酶、蛋白酶K和胃蛋白酶处理发酵上清液后，其抑菌活性减小，初步确定抑菌活性物质为细菌素。进一步通过耐酸、耐胆盐和耐热实验确定1株适合动物肠道定植的乳酸菌R16，16SrDNA基因序列分析鉴定该菌株为乳酸片球菌R16。
1. 产细菌素乳酸菌的筛选
从玉米秸秆、麸皮和豆粕*共中**筛得52株具有溶钙圈的菌株，表明这些菌株可能产生乳酸，对这些菌株做抑菌试验，获得具有抑菌效果的菌株34株，这些菌株的抑菌效果频数分布如图1所示。由图1可知，具有抑菌效果的34 株菌中抑菌圈直径大于5 mm 的有32 株，其中抑菌圈直径大于15 mm 的有16株。考虑到发酵液中有机酸具有一定的抑菌效果，因此选取抑菌圈直径大于15 mm 的菌株进行下一步实验。
2. 产细菌素乳酸菌的复筛
通过排除过氧化氢、有机酸实验以及不同酶对抑菌活性的影响实验，选取有机酸、过氧化氢对抑菌圈影响小且不同酶对抑菌活性影响明显的菌株4 株。以菌株R16为例，菌株R16 排除过氧化氢实验如图2所示，对照的抑菌圈直径为( 20.46±0.18) mm(图2.A)，发酵上清液经80℃水浴处理过后的抑菌圈直径为(18.70±0. 13) mm(图2. B) ，80℃水浴可以去除溶液中的过氧化氢，发酵上清液处理前后抑菌圈大小基本一致，说明菌株R16的抑菌效果不是由过氧化氢引起。菌株R16排除有机酸实验如图2. A/C 所示，有机酸的抑菌圈明显小于菌株R16发酵上清液的抑菌圈，分别为(15. 68±0. 12) mm(图2. C) 和( 20.46±0.18)mm(图2.A)，R11，R13和R17的结果与R16基本一致，由此可以判断菌株R11、R13，R16 和R17 的发酵液中除了有机酸对大肠杆菌有抑制作用外，还有另外一种物质在起作用。不同酶对抑菌活性的影响实验如图3所示。从图3可以看出，胰蛋白酶，蛋白酶K和胃蛋白酶对4株菌株的抑菌活性均有不同的影响。其中菌株R11和R13对蛋白酶K最为敏感，抑菌直径只有7.98mm和7.05 mm;菌株R16和R17对胰蛋白酶最为敏感，抑菌直径只有7.34mm和7.26 mm，菌株R16除了对胰蛋白酶敏感外，对蛋白酶K也具有一定的敏感性。说明具有抑菌活性的物质是一种蛋白质。综合以上实验及相关文献可以初步确定菌株R11、R13，R16 和R17 为细菌素产生菌。
3. 产细菌素且能够耐酸耐胆盐乳酸菌的筛选
菌株R11、R13、R16、R17 在低酸、高胆盐和高温下的菌种存活情况如表1所示。由表1可知，经过37℃温育3h之后，菌株R13和R16对酸和胆盐均具有一定的耐受性，在低pH和高胆盐条件下存活率都很高且都满足活菌数为106 CFU/mL的要求，适合肠道定植；在80℃处理30、60、90、120s后，菌株R13的生长明显减弱，说明高温对其存活率有较大的影响，而菌株R16表现出良好的耐受性，在温度为75-85℃，持续时间为1-2min的制粒过程中，能够保证活菌数满足106CFU/mL。因此，将R16确定为目标菌。
4. 系统发育树构建
根据片球菌属内的不同种16S rDNA序列，通过MEGA5. 0软件的邻位相连法构建菌株R16的系统发育树，见图4。由图4可知，菌株R16与Pediococcus loliiAB362985.1的同源性最高，Pediococcus loliiAB362985.1未见产细菌素的报道。
总结
笔者从玉米秸秆中筛选出1 株能够有效抑制大肠杆菌生长的乳酸菌。通过排除过氧化氢、有机酸对抑菌效果的影响，向发酵上清液中分别加入胃蛋白酶、蛋白酶K 和胰蛋白酶，发现此物质对胰蛋白酶和蛋白酶K敏感，确定该物质为蛋白类物质。通过16S rDNA序列测定和构建系统进化树对所筛选的菌株进行了菌种鉴定，发现所筛选的菌株与乳酸片球菌( Pediococcusacidilactici)的相似度高达99%，将其命名为乳酸片球菌R16( Pediococcus acidilactici R16)。符合农业部《饲料添加剂品种目录》（2013）规定的饲用微生物范畴，具有广阔的市场应用前景。
参考文献
[1] 王娟,蔡国林等.产细菌素的饲用乳酸菌的分离与鉴定[J].食品与发酵工业,2016,42(8):38-43.
[2]ABDEL-RAHMAN M A,TASHIRO Y,ZENDO T,et al．Isolationand characterization of lactic acid bacterium foreffective fermentation of cellobiose into optically pure homoL-( + ) -lactic acid[J].Applied Microbiology and Biotechnology,2011,89(4):1039 -1049．