核桃是蔷薇科桃属植物，主要生长在中国*藏西**等地区，具有耐旱、耐寒、遗传多样性高等优良特点，多酚氧化酶是一类含铜的氧化还原酶，能够催化酚类底物的氧化，在植物中广泛分布。
我们以核桃作为研究材料，利用基因克隆技术获得核桃PmPPO基因，通过生物信息学分析了PmPPO蛋白的理化性质及亚细胞定位;通过对核桃酵母文库的筛选及双荧光素酶互补技术鉴定了PmPPO的互作蛋白:分析了核桃中PmPPO对干旱和外源脱落酸的响应机制:获得PmPPO转基因拟南芥，通过对相关生理指标的测定和基因表达的变化，探究干早胁迫下核桃PmPPO基因的功能。
PmPPO基因对核桃的影响
利用在线分析软件 GOR4 预测目的蛋白的二级结构，PmPPO 蛋白二级结构包含 22.4%的 a-螺旋、16.30%的扩展链和 59.42%的无规则卷曲，主要由无规则卷曲组成;利用在线分析网站InterProScan对核桃 PmPPO 蛋白结构域进行预测，在PmPPO氨基酸序列N端含有 Tyrosinase Cu-bd 结构域，在 ℃ 端具有 PPO1 DWL 结构域和PPOI KFDV 功能未知结构域，蛋白质多肽链在二级结构基础上通过盘曲、折叠形成有一定规律的三维空间结构。
运用 Swiss-Model 在线分析软件对核桃 PmPPO 蛋白的三级结构进行预测，预测出的三级结构模型 PDB 序列号为6els.1.A，其寡聚状态显示为 Monomer，与目标序列的一致度为 86.48%，说明该模型可用于核桃PmPPO蛋白三级结构的分析模型。
蛋白质中的跨膜区通常与细胞功能解密相关，利用 TMHMM 2.0 网站预测 PmPPO蛋白的跨膜结构域，结果如图 3-2D 所示，PmPPO 蛋白不具备跨膜结构域，1-589 位氨基酸位于细胞膜表面。利用 SignalP-4.1在线网站对核桃 PmPPO 蛋白的信号肽进行预测，结果如图 3-2E 所示，原始剪切位点 C-score 分析 PmPPO 蛋白在 16 号位置处得分最高为 0.125、综合剪切位点 Yscore 分析在 16 位置处得分最高为 0.121、信号肽 S-score分析在 1号位置处得分最高为 0.121:信号肽得分的均值S和最大综合剪切位点加权均值 D 分别是 0.120 和 0.137，该蛋白S和 D的值分别为 0.108 和 0.114，均小于标准参数0.450，结果表明核桃 PmPPO 蛋白无信号肽，推测其属于胞内蛋白。
利用 DNAMAN 8.0 对核桃 PmPPO 及其他植物的 PPO 氨基酸序列进行比对分析，结果如图 3-3 所示，PmPPO 的 Tyrosinase Cu-bd 结构域(第 162-371 位氨基酸)、PPO1 DWL 结构域(第 377-428 位氨基酸)及 PPO1 KFDV(第 461-587 位氨基酸)作为蛋白的功能结构域，在多物种之间表现出高度的一致性，进化过程中保持高度的保守性。
运用 MEGA 5.0 软件构建 PmPPO 氨基酸序列的系统发育进化树，结果如图 3-4 所示:选取 12 个与核桃 PmPPO 氨基酸序列同源性较高的物种，构建系统发育进化树，其中核桃 PmPPO 与碧桃 PpPPO 亲缘性最近，与扁桃 PdPPO、杏 PaPPO、东京樱花PyvPPO、柰李PsPPO 次之。
为了探究 PmPPO 蛋白的亚细胞定位情况，利用 Wolf psont 网站预测该蛋白主要位于叶绿体和线粒体中，Psort 网站预测该蛋白可能位于线粒体、细胞核、过氧化酶体及细胞质。构建重组质粒pBI121-PmPPO，利用特异性引物pBI121-PmPPO-F/R 对pMD18-T-PmPPO 质粒进行扩增，将 PCR 扩增产物与双酶切的 pBI121 载体质粒进行胶回收，利用同源重组技术构建表达载体，再转化大肠杆菌中，挑取阳性单克隆菌落进行PCR 验证。
在荧光显微镜下观察，以 GFP 空载体(pBI121)为对照，pBI121-PmPPO 在*草烟**表皮细胞的细胞核和叶绿体中均出现绿色荧光(图 3-6A);在洋葱表皮细胞的细胞膜和细胞核出现荧光反应，结果表明:PmPPO 蛋白定位于细胞核、叶绿体及细胞膜。
PmPPO 基因在核桃的表达分析
分别提取核桃幼嫩植物叶片及根、木质部、韧皮部和两年龄叶片及根的 RNA,并将其反转录为 cDNA，qRT-PCR 检测核桃中 PmPPO 基因的表达量，以 18s作为内参，结果如图 3-16 所示:PmPPO 基因在核桃植株中均有表达，以在木质部的基因表达量作为对照，该基因在核桃的根部的表达量最高，尤其是在幼根中的表达量最为突出;其次在核桃幼嫩叶片中表达量较高。由此可见，PmPPO基因主要在核桃的根部表达、叶片次之，PmPPO基因主要在植物生长前期发挥作用。
取 100 μM ABA 处理 0、1、2、4、8、12和 24 h后的叶片，qRT-PCR 技术检测核桃叶片中 PmPPO 基因的表达量，以 18s作为内参引物，结果如图 3-17A所示:以0h时 PmPPO基因表达量作为对照，在 0-4h基因表达量差异不显著，在8h基因表达量最高，在 12h后基因表达量下降，ABA 处理后该基因表达量呈先上升后下降的趋势。使用 10% PEG6000 处理一年龄核桃植株，分别在 0、1、2、4、8、12 和 24 h测定核桃 PmPPO 基因表达量，在1h目的基因表达量短暂上升，随后目的基因表达量降低，在12h基因表达量显著上调，24h目的基因表达量持续增长。
干旱胁迫处理核桃后，分别在 0、8、12、16 和 20 d检测核桃叶片及根中 PmPPO 基因表达量，结果如图3-17℃ 和D所示:干旱胁迫后，在0-16d核桃叶片中PmPPO基因表达量呈上升趋势，16 d表达量最高，在 20d基因表达量下降，但是高于0d，在核桃叶片中 PmPPO 基因表达量呈先上升后下降趋势，主要在中后期响应干旱胁迫:干旱胁迫后，0-8dPmPPO基因在核桃根部的相对表达量无差异显著性，12d后PmPPO 基因的表达量升高，干旱处理 20 d时达到峰值，核桃根部的目的基因在干旱胁迫后期响应。以上结果表明:核桃的 PmPPO 基因被干早和 PEG6000 诱导表达，并响应 ABA 处理。
将 WT 和 PmPPO 转基因拟南芥置于含有不同浓度的甘露醇或 ABA 的 MS 培养基上培养，根据图 3-19 可知:在 MS 培养基中，OE1和 OE3 转基因株系的主根长度略高于 WT，经过不同浓度的甘露醇处理后，WT 和转基因株系根部的生长均受到不同程度的抑制，转基因株系主根长度显著高于 WT，受到抑制程度较小。
使用不同浓度的 ABA 处理后，WT 和转基因株系的主根长度显著下降，且转基因株系主根长度相较于 WT 受到抑制程度更为明显，这种现象在 25 μM ABA 处理条件下尤为显著(图 3-19C 和 D)。由此可以得出:PmPPO 转基因拟南芥与 WT相比，在甘露醇胁迫下，增强了拟南芥的抗渗透胁迫能力，且对外源 ABA 敏感。
为了进一步验证核桃 PmPPO 基因在干旱胁迫下的功能，本试验选取在营养土中生长两周左右的 WT和转基因拟南芥进行干旱处理，分别在干旱 0、4、10 d及复水2 d(12 d)后进行观察，并测定不同时期的生理指标。
拟南芥受到干旱胁迫后，细胞膜遭到破坏，通过相对电导率变化可以反映这一现象，由图3-20B 可知:在正常条件下 WT 和转基因拟南芥株系之间无差异显著性，干早处理 10 d后，拟南芥叶片相对电导率增长，细胞膜通透性增大，转基因拟南芥的相对电导率低于WT。
干旱影响拟南芥的生长，使叶片中叶绿素的含量降低，测量0d和干旱处理10d后的拟南芥叶片中相对叶绿素含量，结果如图 3-20D所示:在0d时所有拟南芥叶片中的相对叶绿素含量无显著差异，干早处理10d后，所有拟南芥相对叶绿素含量有显著下降趋势，但 WT 的叶片的相对叶绿素含量显著低于转基因拟南芥。因此，在干旱胁迫下，PmPPO 基因在拟南芥中过量表达能够促进叶绿素的积累、调节 PPO 活性及减轻细胞膜损伤，从而增强了植物的抗旱性。
结语
为深入研究 PmPPO 蛋白的特性和功能，体外诱导表达是关键环节之一。本研究探索并优化了 PmPPO 蛋白体外表达的条件，利用镍柱亲和层析法纯化带有 His 标签的重组 PmPPO 蛋白。本试验结果显示:PmPPO 蛋白主要以不可溶蛋白的形式存在，沉淀中蛋白表达量较高。生物信息学预测蛋白的相对分子质量为65.45 kDa，而在 SDS-PAGE检测的蛋白胶图中蛋白的分子量相比预测值偏大，这可能是由于 His 标签中含有6个His 带有较强的正电荷，降低了 PmPPO 蛋白的泳动速率。
有关研究表明通过对茶树CSPPO 蛋白的外源表达发现，在 pMAL-c5X载体表达可获得可溶性蛋白，而在 pET-32a载体中则不能过得可溶性蛋白，利用不同 pH 值及不同底物处理目的蛋白，PPO 的比活力存在差异!721。构建芝麻 pMAL-c5X-BSPPO 重组表达载体，利用不同的金属离子、pH值以及底物处理纯化后的目的蛋白，探究芝麻 BSPPO 的酶学特性。