文|胡叁叔

编辑|胡叁叔

前言

啤酒大曲中包含着大量的微生物 ，这些微生物可以将啤酒中的原材料转化为葡萄酒中的香气成分，而这些微生物的组成和含量，会对葡萄酒的风格和品质产生很大的影响。

因此，对啤酒大曲中的微生物群进行解析，可以帮助我们更好地理解啤酒生产中的微生物。

在啤酒生产中，大曲中的优势菌群以及它们之间的相互关系，可以帮助我们 更好地理解啤酒生产中的各种微生物。

我国对于酒曲的相关研究主要侧重于对其 微生物组成结构、理化特性、功能菌群 等方面。

施安辉等以山东梁山“徐坊”大曲为对象 ，在其主要菌种中，细菌、酵母、霉菌等在总培养微生物中的比例及主要菌种种类上均有差别。

徐瑾等以 PCR-DGGE技术为基础 ，筛选出在各种理化环境下，样本菌群的最适分析环境，并对样本菌群的组成进行了分析。

雷震河以大曲为对象，通过对其微生物组成的研究，获得了大曲中主要 细菌门、变形菌门等，并对其主要菌种 进行了深入的研究。

曹苗文等以香醇为对象，通过对功能曲的使用，发现添加功能曲后， 酒体中的物质组成会产生很大的变化。

当前在 香醇大曲中 ，以酿酒技术为主，但对香醇大曲中菌群结构的研究还很少，利用高通量测序技术对香醇大曲中的菌群结构进行了全面的分析。

材料与方法

采样方式：从厂家生产的破碎储存7日的大曲中，随机抽出酒曲袋装，取袋中上部、中部、下部酒曲混合，编号为DQ。

将10g啤酒大曲样本放入无菌袋中，快速封存于-20℃下.将样本前处理后，采用 OMEGA技术从样本中抽取DNA，并将其用于PCR的引物。

首先需要把得到的双端测序资料拼接起来，形成一个完整的序列，然后对全部样本的原始资料进行品质过滤，从而得到一个有效的标记。

表2是将样本中的 双末端序列进行拼合后获得的原始和筛选后的数据 ，通过比较可以发现样本中的双末端序列在筛选后减少了有效的序列数量。

在此基础上，进一步改进了对目标序列的分析，使其与目标序列的长度更加相近，从而改善了对目标序列的分析精度。

按照97%的相似性阈值，将质控后的序列作为一个运算分类单位进行聚类，从而得到 OTU的序列数目。

16S测序得到的OTU序列数目是57402个 ，ITS测序得到的OTU序列数目是70631个；16S序列和ITS序列分别为126和48个候选基因。

本项目拟 采用QIIME与SILVA两种数据对OTUs进行全面系统的研究 ，通过对OTUs特征基因的研究，揭示OTUs中的细菌数目比真菌数目要多。

利用评估 Alpha多样性指数 ，可以对微生物群落的多样性、丰富度和均匀程度进行表征，在97%的相似度水平下，样本Alpha多样性指数值具体如下图所示。

真菌与大曲中的细菌相比较， ACE、Chao和Shannon指数都比较高 ，而Simpson指数较低，这说明了细菌类群中种类的数量较多，而细菌菌群丰富度大于真菌，这就说明了细菌可能在啤酒过程中起着非常关键的作用。

标本中的 细菌与霉菌Coverage值都大于0.99 ，表明该序列在标本中被检测到的可能性很大，标本文库的覆盖度也很高，这表明此次测序可以很好地反应标本中的菌群。

图1是在所构造的持续取样下， 新OTUs出现的稀疏性曲线 ：一开始，这条曲线会随着测序条数的增加而迅速上升，这说明样本中出现了很多的种类。

当稀疏度曲线变得平缓时 ，表明序列信息已经达到了一个临界值，意味着样本的数量足够涵盖全部的细菌与真菌。

对样本在门水平进行物种多样性组成分析可知 ，大曲样本细菌在门水平主要有五大门类：变形菌门、厚壁菌门、蓝细菌门、放线菌门、拟杆菌门。

清香型白酒大曲中细菌 在门水平上还存在所占一定比例的未分类菌群和其他菌群，其中变形菌门占43.8%、厚壁菌门占37.3%和蓝细菌门占13.5%为细菌门类的优势菌群。

通过与张双燕等人的芳香型大曲中的微生物构成进行比较，发现样本大曲菌群的物种构成与其使用的大曲类似，但每种菌群的比例却有不同。

而在 菌种层面上，非归类菌和其它菌种的数量占到了总数的17.7%， 而在菌种层面上，泛菌属占35.4%，乳杆菌属为17.5%，链霉菌属为13.5%。

乳酸菌 是一种可以生成乳酸等酒体前体物并对其进行调控的微生物，对酒体品质起着非常关键的作用，其数量直接关系到酒体品质。

芳香型白酒大曲的菌种包括 ：孢圆酵母、伊萨酵母、毕赤酵母、生丝毕赤酵母、根霉、双足囊菌、曲霉、横梗霉、假丝酵母、念珠菌、酵母、丝孢酵母等。

孢圆酵母属在真菌菌群属水平占有绝对优势 ，为酿酒生产提供能量，对促进高梁高效利用和提升出酒质量起着关键作用。

从样本细菌中，注释到了4167个COG ，根据表4可以看出，这些COG属于23个功能类别中。

在细菌中 氨基酸转运与代谢、碳水化合物运输和代谢的高表达 ，造成这种情况的原因，很可能与香气型堡子酒大曲的制作工艺有关系。

堡子酒大曲以大麦、豌豆等作为主要原材料，在酿酒的过程中，需要微生物进行发酵分解。

利用 FUNGuild 对香气型白酒大曲进行了营养型与功能群的分析，得到了如下表5：大曲分为三种营养型，即病态营养型，腐生营养型，共生型，分别占34.2%，17.7%,14.3%，其他为FUNGuild暂时无法识别的功能群。

从营养型上看，大曲中真菌主要为病态营养型，所占比例明显大于腐生营养型与共生型，这说明了香气型白酒大曲对病态营养型真菌的有益。

结论

本研究利用 高通量测序技术 ，对香气型白酒大曲微生物的菌群特点进行了分析，明确了样本大曲中的微生物群落结构，并对其进行了功能基因的预测。

利用测序对大曲样本展开了分析 ，结果显示大曲中的细菌和真菌在各个水平上的菌群分布情况都有不同，并且细菌的丰度和均一度都高于真菌。

在 真菌菌群属层次上，孢圆酵母属占据了绝对的主导地位 ，其比例达到了52.6%。

氨基酸转运与代谢、碳水化合物运输和代谢、转录、一般功能预测表达水平较高的结论， 结果表明该菌株可分为3种营养类型和6种功能性类群。

参考文献：

［1］吴生文，张志刚，李旭晖《大曲微生物在大曲酒生产中的研究开发现状及发展前景》

［2］管健，廖蓓，李兆飞，魏浩林，曹敬华，陈茂彬，方尚玲《白酒功能菌的功能特性及应用研究》

［3］贾丽艳，荆旭，田宇敏，王晓勇，刘帅《传统清香型白酒发酵过程中细菌群落结构及其动态演替》

［4］贾丽艳，田宇敏，王晓勇，耿添霈，韩英《传统清香型白酒发酵过程中真菌群落结构及其动态演替》