20211218记 蛋白互作之细菌双杂交技术
1. 蛋白互作研究
² 生命活动是一个复杂的协作过程，任何一个信号的传导到效应产生都需要多种蛋白参与，蛋白或上下游关系或平行的合作关系，研究方法包括酵母双杂交、免疫共沉淀、GST-pull down，磷酸化或乙酰化等，今天我们要介绍的是Stratagene 的细菌双杂试剂盒。
2. 细菌双杂交实验
² 将 A蛋白作诱饵蛋白，与噬菌体全长 λ 抑制蛋白（λcI, 237 个氨基酸） 融合， 依赖 λcI 的氨基端 DNA 结合域结合到报告基因启动子上游的 λ 操纵子， 得到重组质粒 pBT-A。
² 将 B蛋白作为靶标蛋白与 RNA 聚合酶 α 亚单位氨基端融合，得到重组质粒 pTRG-B。
² 当二者存在相互作用时，诱饵蛋白 A 会招募并固定结合在启动子位置的 RNA聚合酶，从而激活 His3 基因和第二个编码链霉素抗性蛋白的基因 aadA 的转录，使其具有 3-AT 和链霉素的双重抗性。
² 将两个重组质粒同时导入报告菌株（其 f′附加体含有报告基因）， 得到 A和 B 同时表达的实验菌株，将重组质粒和对应空载同时导入报告菌株，得到单独表达 A 或 B的阴性对照菌株，同时表达已知存在相互作用的 Gal11P 和 LGF2 做阳性对照。
² 若结果只有 A 与 B 蛋白同时表达的菌株和阳性对照菌株能在双筛板生长，则表明 A 可以与B 直接相互作用。
细菌双杂交系统的原理图
将诱饵蛋白基因和靶蛋白基因分别插入到 pBT 和 pTRG 质粒后，将两个重组质粒一起导入报告菌株中，当两个蛋白有相互作用，可以激活 His3 和 aadA 两个报告基因。 His3 编码组氨酸合成途径中的一个组分，可以回补报告菌株中 hisB 基因突变； aadA 是链霉素抗性基因。