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图片来源：http://zlab.mit.edu/team.html
张锋 CRISPR-Cas9基因编辑技术的专利官司今天出结果了。美国专利局法庭（注一）宣布张锋获胜。
众所周知，Doudna在2012年六月发表论文，首次报道运用CRISPR-Cas9在试管中实现DN*片A**段的切割。6个月后的2013年1月，张锋的研究小组发表论文，在人类细胞中用CRISPR-Cas9实现基因编辑，并很快申请了专利。2016年3月，Doudna提出专利干扰诉讼，称张锋的发明显然是在她的专利基础上的事情。据报道，双方为了专利诉讼花了千万美元的律师费。
在此之前，我对张锋的了解仅仅是在韩春雨事件中听过其名而已，而且似乎有人对他的名气还存在疑问。在阅读相关资料后，我发现张锋才是CRISPR -Cas9技术的集大成者。围绕双方的争议，我写了若干博文。介绍了CRISPR-Cas9基因编辑技术，也分析了张锋与DOUDNA在CRISPR-Cas9的专利官司。相关介绍参见：《张峰专利官司科普及案情发展-叛逃者将被UC传讯》、《CRISPR基因编辑技术及张锋的贡献》、《CRISPR基因编辑技术的显然性分析》、《CRISPR基因编辑研究秘辛大起底》、《发自张锋实验室的四封CRISPR邮件》。（相关内容请点击下方 阅读原文 移步作者科学网博客了解）
在《CRISPR基因编辑技术及张锋的贡献》（见下）一文中，我结论到 【张锋首次将CRISPR-Cas9成功用于高等生物的基因编辑，其主要成果是基于2011年Charpentier的tracrRNA发现】。在2012年初，也就是Doudna论文发表前半年，张锋就已经提交了完整的真核细胞基因编辑设计。张后来的论文结果基本是基于这个设计。
事件中，张锋实验室还出了一个中国留学生背叛者，向DOUDNA提供内部消息。但这个学生提供的电子邮件等信息恰恰证明张锋在 2012年初就开始了相关真核细胞的基因编辑研究，并且明显找到了关键。而DOUDNA在其2012年论文发表之后数个月仍未能成功实现真核细胞的基因编辑，直到张锋合作伙伴CHURCH提供了真核编辑的数据之后才获得成功。
根据张锋所在布罗德研究院的声明，美国专利局法庭在2月15日宣布，Doudna针对张锋的真核细胞CRISPR-Cas9基因编辑技术的专利干扰诉求不成立。美国专利局判决称：
➤Doudna与Vilnius的专利申请只是在试管中剪切DN*片A**段，没有涉及细胞、基因组，也没有基因编辑。（The applications filed in 2012 by the Vilnius team and the Berkeley team each showed only that purified Cas9 protein and a certain purified RNA could cut a short piece of DNA in a solution in a test tube. In both cases, the applications in 2012 contained no cells, no genomes, and no editing.）
➤Vilnius的专利申请只是自然系统不能申请专利（专利必须是人脑的创造，自然现象不能申请专利）（The USPTO rejected the Vilnius application as not having significantly more than a study of the natural system and failing to describe invention.）
➤张锋的真核细胞基因编辑专利不受Doudna专利影响。
对相关技术感兴趣的读者可以参阅《CRISPR基因编辑技术的显然性分析》等博文。另外，科技时代，科学技术是财富。据报道，去年 Doudna 专利官司启动后，张锋的 EDITAS 公司股价从 $42 开始大跌，最低只有13。今天 EDITAS 大涨 30%，达到 $24。张锋的财富量在10年内可能超过到处捣房地产的美国总统川普家族。
虽然科学研究的目的是为人类文明做贡献，而不是获取，但能用科技智慧创造财富也许更能够激励人们进行科学探索。
科学网的生物学家们都有希望。加油！
注一：读者可能问，专利局怎么有法庭，这个问题我在之前解释过——这叫administrative law court.
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CRISPR 基因编辑技术及张锋的贡献
地球上所有细胞生物的遗传信息都储存在数字化的DNA序列中。今天，基因测序技术已经非常发达，DNA序列可以非常廉价迅速的确定。但测序只是读取数据，近年生物学最大的发现与发明之一是可编程的基因编辑技术：CRISPR-Cas9。这个技术类似于 WORD的搜索替换功能：用户输入一串字符串，程序找到匹配的字符串，然后进行删除或者替换。CRISPR-Cas9的编辑技术里，搜索匹配字符串由实验人员通过一段RNA表示，叫做导引RNA——gRNA，编辑由一个称为Cas9的蛋白根据gRNA定位完成。这个编辑系统的灵活性显而易见。Cas9蛋白是固定的，你只需要改变导引就能在不同位置对DNA进行编辑（注一）。
CRISPR-Cas9技术的来源是细菌的自然免疫系统。某些细菌在遭到病毒入侵后，能够把病毒基因的一小段存储到自身的DNA里一个称为CRISPR的存储空间。当再次遇到病毒入侵时，细菌能够根据存写的片段识别病毒，将病毒的DNA切断而使之失效。有的细菌的CRISPR系统很复杂，涉及多种Cas蛋白（Cas的意思是CRISPR-associated——与CRISPR相联的）。经过多年的研究，生物学家们终于找到了一种简单的系统，只用到一种蛋白——Cas9。接下来，他们成功地把这个细菌的系统进行改造用于动植物细胞的基因编辑。率先完成这一实际应用性开发的是张锋的研究小组。本文试图对相关技术与历史进行简单的介绍。
这里我把CRISPR之前漫长的研究历史一笔带过。简单而言，人们之前发现细菌免疫系统依靠一段很短的RNA进行识别，这段RNA称为crRNA（CRISPR RNA）。可想而知，这段crRNA包含有入侵病毒的基因识别码。
CRISPR相关研究在2011年取得了重大突破。这一年，法国女科学家Emmanuelle Charpentier报告，通过基因分析与相关实验，发现一个只有四个组件的细菌免疫系统。除了Csn1蛋白（后来称为 Cas9）与crRNA外，还发现一个他们称之为trans-activating CRISPR RNA（简称tracrRNA）的RNA。顾名思义，这个tracrRNA 起到转写-启动的功能。第四个组件是一个作用于RNA的生成，称为RNase III的蛋白。但这篇2011年的论文对各个组件的具体功能并没有完全确定。其论文中的下图显示：蓝色是Cas9蛋白，红色的是tracrRNA, 绿色+黑色线段是crRNA（其中绿色部分对应需要识别的病毒编码），黄色是RNase III。
Charpentier 的论文发表后，美国加州大学的 DOUDNA（“道得娜”——有些中文文章音译成“多德娜”属于错误读音）与她的研究小组隔洋合作，进行了进一步研究，于2012年6月发表了一篇重要论文。相关研究人员与主要结果如下图：
DOUDNA、Charpentier 联合小组通过在细胞体外的试管实验发现了负责DNA切割的充分并且必要的三个部分：Cas9, crRNA与tracrRNA（不需要RNase III）。论文还确定了三个部分的作用：其中Cas9是切割机，crRNA的主要作用是定位。而tracrRNA在与crRNA耦合后启动Cas9的切割功能(activate)。他们还成功把 crRNA与tracrRNA 连起来成为一个分子，这样可以把DNA切割的组件由三个变成两个。如上图。左边是自然原核细菌中的机制，两个RNA分子。右边则是人工机制，把两个RNA给连起来了，成为一个带着一个配对圈的RNA分子。但DOUDNA等人的实验并没有在任何细胞内进行，只是在细胞体外的试管里，当然也没有在动植物等真核细胞内实验，也不知道能否可行(“it was not known whether such a bacterial system [the CRISPR-Cas9 system] would function in eukaryotic cells.”）。在该论文发表后几个月，DOUDNA等人表示在真核细胞的实验中遇到了很多困扰（"many frustrations"）。
现在我们知道，Charpentier 2011年的论文出来后，美国东部 BROAD研究院的张锋小组也展开了研究。在Doudna/Charpentier 2012年6月论文发表前半年，张锋在2012年1月向NIH申请了一个项目：运用Cas9系统对真核细胞进行基因编辑。张锋的项目设计如下（从其项目申请截图）：
上图是一个哺乳动物 CRISPR 基因编辑系统的设计。其代码进行表达后会生成四个部分：（1）带NLS的Cas9 蛋白，（2）tracrRNA , （3）多个crRNA——注意不同颜色的线段 (图中称为 guide RNA array)，(4) 带NLS的RNase III。真核细胞的特点是遗传物质在细胞核内，一般较大的蛋白是进不去的。其中 的NLS是为了使Cas9等生成后能够被拖入细胞核内。可以这么说，张锋的思路是先不管具体机制是什么，直接在高等生物上进行基因编辑实验，而且多点编辑同时进行。
张锋小组的核心人物包括：张锋、丛乐、FEI RAN
张的小组在2013年1月发表论文，报告了他们的发现：（1）他们对四个组件进行了组合实验，发现基因编辑不需要 RNase III；（2）使用Cas9 、crRNA与tracrRNA组合，成功对真核细胞实现编辑，效率相当高（indel达19%）；（3）使用DOUDNA论文中的嵌合RNA (chimera)，发现长的那个（chimera A ）编辑效率较双RNA系统低(最高5.6%, 部分无法探测），短的那个(chimera B)不能编辑（注二）。如下图：
结论：
张锋首次将 CRISPR-Cas9 成功用于高等生物的基因编辑，其主要成果是基于2011年Charpentier的tracrRNA发现（注三）。
注一：Cas9 的工作机制是先找到 DNA上的一个特定的称为 PAM的序列，然后才是导引与DNA链的结合以及切割。所以，可行的DNA切割点不是任意的。ＰＡＭ是一个限制。不同细菌的Cas9 蛋白的ＰＡＭ序列不同，有的长些，有的只有三个字符，所以要找到可行的切割点也不是难事。
注二：后来的研究发现组合chimera RNA加长后效率更高。
注三：张锋后来又发现一个系统——CRISPR/Cpf1，蛋白比Cas9小，只需要crRNA（不需要tracrRNA), 切割位置离PAM远。
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