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大面积骨缺损的修复重建历来是骨组织工程的难点问题，近年来多项研究证实，骨缺损区域的早期血管化可以有效促进最终的骨再生修复[1-2]。一方面，新生血管可以为骨代谢提供必要的营养物质和氧气[3]，另一方面，新生血管分泌多种细胞因子如PDGF-α，PDGF-β，Noggin等促进骨组细胞和巨噬细胞在骨缺损部位募集并且促进骨组细胞的成骨分化[4]。甲磺酸去铁胺（deferoxamine，DFO）是目前血管组织工程常用的药物，其作用机制为：通过螯合Fe3+，激活HIF-1a通路，促进下游信号分子VEGF的表达，进而促进血管再生。但是DFO血浆半衰期短（在小鼠中t1/2=5min），易被降解等性质限制了其生物学应用。因此，寻找合适的载体负载DFO以延长其半衰期，成为亟待解决的难题。
最近， 四川大学华西口腔医（学）院/口腔疾病国家重点实验室 王剑教授/陈俊宇副教授大课题组选择类沸石咪唑酯骨架-8（ZIF-8）作为DFO的载体以延长DFO半衰期减少给药次数 。ZIF-8是MOFs的一个亚类，具有生物相容性好，比表面积大，粒径可调等优点，既往研究表明，ZIF-8作为载体用于负载蛋白质，酶，核酸至特定部位。 课题组前期研究证实，ZIF-8除了可以作为载体之外，其本身可以通过激活MAPK通路促进BMSCs成骨分化。本课题通过一锅法合成DFO@ZIF-8载药体系，构建成血管-成骨偶联复合体，DFO和Zn2+在促进血管化和骨再生方面均存在协同作用。 该研究成果以“Drug-Delivery Nanoplatform with Synergistic Regulation of Angiogenesis−Osteogenesis Coupling for Promoting Vascularized Bone Regeneration”为题发表在《 ACS Applied Materials & Interfaces 》上。论文的第一作者为华西口腔硕士研究生李亚红。
DFO@ZIF-8纳米粒子与人脐静脉内皮细胞HUVECs、骨髓间充质干细胞BMSCs、成骨细胞osteobalst相互作用
该团队通过一锅法合成不同载药量的DFO@ZIF-8（DFO 2.5@ZIF-8,DFO 5@ZIF-8,DFO 7.5@ZIF-8,DFO 10@ZIF-8）载药体系，并通过SEM,TEM,XRD,FT-IR进行初步表征,结果显示合成的ZIF-8及DFO@ZIF-8纳米粒子的粒径约为100-200nm，DFO@ZIF-8载药体系特征峰与标准ZIF-8特征峰相吻合（图1）。
随后通过紫外分光光度计检测各载药体系载药率和包封率，最终选择载药率最高的DFO 7.5@ZIF-8用于后续表征。TEM Mapping显示DFO 7.5@ZIF-8纳米粒子中含有DFO特征性的S元素；Zn2+及DFO的释放动力学表明，ZIF-8载体在前24h崩解速度最快，在4天左右几乎完全崩解，其中的Zn+和DFO释放出来发挥功能（图2）。
图1 DFO@ZIF-8纳米粒子合成和初步表征
图2 DFO@ZIF-8纳米粒子载药率的测定和药物释放动力学
材料良好的生物相容性是材料可用于体内外实验的前提和基础。本课题通过CCK-8，细胞黏附实验，活死细胞染色筛选出浓度为30ug/ml的DFO@ZIF-8纳米粒子用于后续探究,并将纯ZIF-8组和纯DFO组作为实验对照组，Con组作为空白对照组。HUVECs和BMSCs胞吞实验证实，DFO@ZIF-8纳米粒子在6h之内可以被细胞吞噬，进入细胞体内发挥功能。HUVECs和BMSCs共培养显示，DFO@ZIF-8组可以明显促进BMSCs细胞的扩展和增殖，为之后的成血管—成骨偶联的研究奠定基础。（图3）
图3 Con组，DFO组，ZIF-8组，DFO@ZIF-8组体外生物相容性检测
HUVECs划痕实验，Transwell实验，成管实验及成血管相关基因 VEGF-a 和 HIF-1α 的PCR结果证实，DFO@ZIF-8组具有优异的促体外成血管性能（图4）；BMSCs碱性磷酸酶染色，茜素红染色及成骨相关基因 Alp，Runx-2，Ocn，Bmp-2 的PCR结果证实DFO@ZIF-8纳米粒子组具有优异的促体外成骨性能（图5）。
图4 Con组，DFO组，ZIF-8组，DFO@ZIF-8组体外成血管性能检测
图5 Con组，DFO组，ZIF-8组，DFO@ZIF-8组体外促成骨性能检测
由于纳米粒子用于体内实验时候，无法直接固定，所以本课题利用生物相容性好的海藻酸钠SA水凝胶作为DFO@ZIF-8纳米粒子的载体，通过构建大鼠颅骨极限骨缺损模型，研究DFO@ZIF-8纳米粒子体内促血管化骨再生效果。两周后颅骨收样进行早期血管化检测，4周后颅骨收样进行晚期骨再生的检测，并且在该时间点收集大鼠的心，肝，脾，肺，肾标本和静脉血样本，进行五脏组织学分析和血液样本的血常规、血生化分析。
心，肝，脾，肺，肾标本的H&E染色证实，各组别未表现出明显组织损伤；各血常规/血生化指标在生理范围之内。（图6）
图6 SA，SA/DFO组，SA/ZIF-8组，SA/DFO@ZIF-8组体内生物安全性检测
通过对颅骨样本血管相关标记物的免疫荧光染色评估DFO@ZIF-8纳米粒子组早期血管化效果。CD31/a-SMA/DAPI标记常规血管网络，CD31/EMCN/DAPI标记H血管（H血管被证实是促进成血管-成骨偶联的关键血管）。染色结果表明，在4个组别中，DFO@ZIF-8组常规血管生成量和H血管生成量最多，证实了DFO@ZIF-8纳米粒子可以在骨缺损早期促进血管的生成。（图7）
颅骨样本CT重建分析、H&E、Masson染色结果验证了DFO@ZIF-8组新骨生成量最多；成血管/成骨标记物免疫荧光染色（a-SMA/CD31/OCN）证实DFO@ZIF-8组显著提升了骨缺损部位的血管标记物和骨标记物的表达，从分子层面证实了DFO@ZIF-8纳米粒子优异的促血管化骨再生的效果（图8）。
图7 DFO@ZIF-8纳米粒子促进骨缺损部位早期血管化的检测
图8 DFO@ZIF-8纳米粒子促进骨缺损部位晚期骨再生的检测
为了进一步研究DFO@ZIF-8纳米粒子促进成血管-成骨偶联的机制，本课题进行了转录组测序，筛选出PI3K-AKT-MMMP2/MMP-9和HIF-1a信号通路，进一步验证了DFO@ZIF-8纳米粒子释放出的DFO和Zn2+的双重协同作用，具体机制为：首先在血管再生方面，Zn2+通过激活PI3K-AKT通路促进MMP2/9的表达，导致原血管基底膜破裂，内皮细胞释放出来，随后，DFO激活的HIF-1a通路，增加VEGF的表达，促进内皮细胞迁移及向不同亚型（tip cell及stalk cell）分化并形成最后的血管。在骨再生方面，一方面新生血管可以为骨代谢提供营养物质和氧气，并促进骨组细胞和巨噬细胞向骨缺损部位的募集和骨祖细胞的成骨向分化；另一方面 Zn2+也可通过激活MAPK通路促进成骨分化，共同促进最后的骨再生（图9e）
图9 DFO@ZIF-8纳米粒子促进血管化骨再生的协同机制
【文章结论与讨论，启发与展望】
总之，本工作通过一锅法合成DFO@ZIF-8纳米载药体系并进行了材料表征，通过体外实验证实DFO@ZIF-8纳米粒子优异的促成血管和成骨性能；随后通过构建颅骨缺损模型验证DFO@ZIF-8组可以促进骨缺损部位的早期血管化和晚期骨再生，并通过转录组测序挖掘DFO和Zn2+的协同机制。本实验的材料设计理念为通过促进成血管—成骨偶联促进骨再生，该理念可以为大面积骨缺损的修复提供新思路。
参考文献
(1) Wang, R.; Ozsvar, J.; Aghaei-Ghareh-Bolagh, B.; Hiob, M. A.;Mithieux, S. M.; Weiss, A. S. Freestanding Hierarchical Vascular Structures Engineered from Ice. Biomaterials 2019, 192, 334−345.
(2) Zhu, S.; Bennett, S.; Kuek, V.; Xiang, C.; Xu, H.; Rosen, V.; Xu,J. Endothelial Cells Produce Angiocrine Factors to Regulate Bone and Cartilage Via Versatile Mechanisms. Theranostics 2020, 10, 5957−5965.
(3)Feng, H.; Li, Z.; Xie, W.; Wan, Q.; Guo, Y.; Chen, J.; Wang, J.;Pei, X. Delivery of Therapeutic MiRNAs Using Nanoscale Zeolitic Imidazolate Framework for Accelerating Vascularized Bone Regeneration. Chem. Eng. J. 2022, 430, 132867.
(4)Rafii, S.; Butler, J. M.; Ding, B.-S. Angiocrine Functions of Organ-Specific Endothelial Cells. Nature 2016, 529, 316−325.
原文链接：https://pubs.acs.org/doi/10.1021/acsami.2c23107
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