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一、前言

人体是众多微生物的天然栖息地，其中细菌是微生物群的主要组成部分。这些细菌定殖于能为它们提供合适生存条件的部位。许多共生或致病的细菌物都会通过生化信号与宿主相互作用。基于这些细菌特性，共生和减毒病原菌已被设计用于递送治疗分子以靶向性治疗特定疾病。2022年5月，新加坡国立大学的Matthew Wook Chang教授等在 Advanced Drug Delivery Reviews 上发表综述，重点介绍了用于治疗或预防各种疾病的工程化细菌或细菌衍生颗粒及其封装、分泌、表达表面治疗分子的过程，同时讨论了微生物药物递送系统的临床转化潜力。

二、介绍

人体包含了一个由真核生物、古细菌、细菌和噬菌体等组成的庞大微生物群落。其中， 细菌是最主要的成员，其数量与人体细胞的数量级相同。 经过多年的共同进化，各种细菌优先占据了胃肠道、呼吸道、口腔、生殖器官和皮肤等人体不同的生态部位。这些共生体的已经适应了通过不断交换代谢物与人类细胞交流的方式，因此，许多共生细菌已被证明在预防和维持动脉粥样硬化、溃疡性结肠炎等疾病方面发挥着关键作用。

细菌细胞和细菌衍生颗粒——细菌幽灵、微细胞和细菌膜囊泡——是封闭的微米和亚微米脂质颗粒，具有作为药物输送系统的独特优势。 围绕原核染色体构建的细菌细胞是复杂且可自我维持的微型机器人，并在其遗传物质的控制下发挥作用和进化。随着合成生物学的进步，对这些遗传物质进行操纵能够利用自上而下的工程方法来修改细菌细胞的结构成分，将人工功能整合到细菌细胞中，并指导它们在微观尺度上完成复杂的任务。与化学合成的脂质颗粒相比，作为递送载体的细菌和细菌衍生颗粒是活的、可编程的，并且在生理条件下更稳定。利用这些特性，先前的研究已经探索了使用细菌和细菌衍生颗粒将内在表达或化学负载的治疗分子递送到人体特定位置以进行疾病治疗的潜在应用。

本文讨论了工程化细菌的应用策略： 1) 作为持续释放治疗剂的微生物细胞工厂； 2) 作为疾病特异性释放治疗剂的感知和响应系统； 3) 用于癌症治疗的靶向药物递送系统。此外，介绍了细菌衍生颗粒(细菌幽灵、微细胞和细菌膜载体)作为高级药物递送载体的研究进展。

三、微生物细胞工厂生产治疗剂

与其他现有的传统药物递送方式相比，工程化细菌递送系统具有其优势，它们是活的，注入体内后可以执行各种生物过程，包括与微环境相互作用，以实现使用当前药物输送系统难以比拟的精确响应。 这种生物过程可以是自然发生的，也可以通过基因工程引入目标细菌中。这包括治疗剂的生产，其中益生菌作为微生物细胞工厂，不断产生具有治疗作用的蛋白质或代谢物。这些细菌可以定植在口腔、鼻腔、胃肠道或皮肤中，可用于治疗多种疾病。鉴于此， 微生物细胞工厂的设计原则包括： 1) 使用细菌作为靶向特定解剖位置的递送底盘； 2) 细菌能够稳定且持续地释放天然或整合的治疗剂。

Isabella等进行的一项研究中，一种经过基因工程改造的肠道共生微生物大肠杆菌Nissle1917(EcN)可以治疗苯*酮丙**尿症(一种以血液中高水平苯丙氨酸(Phe)为特征的代谢疾病)。苯*酮丙**尿症的传统疗法是通过饮食干预或提供辅助因子以提高天然Phe降解酶的活性，进而实现治疗目的，然而，这些方法依从性差，单一疗法效果差。作为一种替代策略(图1a)，Isabella等改造EcN以表达Phe代谢酶，从而降低肠道循环的Phe水平。结果表明工程微生物可以显著降低苯*酮丙**尿症小鼠模型和高饮食Phe食蟹猴的Phe水平。此外，工程微生物的生长依赖于外源性二氨基庚二酸盐，而在小鼠肠道和环境样本中发现这种物质含量不足，从而确保了工程微生物的生物安全性。Durrer等人改造罗伊氏乳杆菌使其在肠道中持续分泌Phe代谢酶苯丙氨酸解氨酶以调节Phe水平，给药后3-4天内可降低苯*酮丙**尿症小鼠模型中的循环Phe水平。此外，初步筛选发现小鼠对分泌酶没有免疫反应，而全身注射聚乙二醇苯丙氨酸解氨酶后却观察到几种免疫相关的不良反应。

一些研究使用益生菌来调节宿主免疫反应以治疗炎症性肠病(IBD)、溃疡性结肠炎和克罗恩病。这些疾病的现有疗法主要是抗炎或免疫抑制药物治疗，然而，这些药物通常疗效不佳，原因除了与这些药物相关的多种不良反应外，原因在于很大一部分患者对治疗没有反应。Steidler等对乳酸乳球菌进行基因改造使其在肠道中组成型分泌抗炎细胞因子白细胞介素10(IL-10)(图1d)。这种益生菌可将小鼠的结肠炎减少50%，并显示出与全身给药IL-10相似的疗效，但由于药物的靶向递送问题，其浓度比腹腔注射的低几个数量级。虽然II期临床试验中发现这种工程益生菌在治疗IBD方面无效，但其他研究已经使用乳酸乳球菌在结肠炎小鼠的肠道中组成性地递送IL-27。这种疗法在减轻小鼠结肠炎方面比产生IL-10的乳酸乳球菌或全身施用IL-27本身具有更高的疗效。

图1：微生物细胞工厂原位递送治疗剂

益生菌也可以用于皮肤进行直接治疗 (图1c)。Vagesjo等设计了罗伊氏乳杆菌以产生趋化因子CXCL12，从而在局部给药时加速伤口愈合。CXCL12参与将巨噬细胞募集到伤口部位促进组织恢复。由于伤口的蛋白水解性质，将生长因子直接递送至伤口部位可能效果不佳。作者发现，由于乳酸的天然生成，罗伊氏乳杆菌会降低伤口部位的pH值，这有助于延长CXCL12的生物利用度，因为CD26针对CXCL12的肽酶活性由于pH值的降低而受到抑制。表达CXCL12的工程化罗伊氏乳杆菌可加速与慢性伤口相关的高血糖或外周缺血小鼠和人体皮肤伤口模型的局部伤口愈合。此前，Ilya Pharma使用这种工程益生菌完成了一项I期临床试验，并称伤口愈合平均缩短了3天，II期试验正在进行。

肠道微生物群与神经系统和心血管疾病发展之间日益密切的相关性为口服益生菌调节微生物群以靶向治疗这些疾病提供了新的机会。 Chen等使用乳酸乳球菌在小鼠肠道中持续输送胰高血糖素样肽1(GLP-1)以治疗脂多糖引起的记忆障碍，并改善空间学习。将血管紧张素转化酶2(ACE2)融合到霍乱毒素的无毒亚基B上以促进跨粘膜运输的基因改造使得副干酪乳杆菌可以递送血管紧张素转化酶2(ACE2)。在两种糖尿病视网膜病变小鼠模型中，工程益生菌降低了视网膜炎性细胞因子的表达，减少了脱细胞毛细血管。修饰酶的活性在血清和组织样本中均得到证实。多种研究也探索了使用口服疫苗(一种表达抗原的转基因益生菌)来诱发免疫反应并对抗特定的细菌或病毒病原体。Gao等改造干酪乳杆菌以组成型表达和分泌产气荚膜梭菌α-毒素类毒素，以开发针对产气荚膜梭菌感染的疫苗。在用工程益生菌处理的小鼠中，在肠粘液和粪便以及血清中发现了可以中和产气荚膜梭菌α毒素的特异性IgG和IgA抗体。同样，乳酸乳杆菌被设计为在益生菌表面表达HIV-1 Gag-p24，能够引发针对HIV的IgA和IgG反应。

四、感知及响应系统

除了作为微生物细胞工厂外，感知和响应系统也可以整合到工程益生菌中。 这些系统中，细菌的感觉模块感知疾病特异性信号，进而激活响应模块以产生治疗分子(图2)。感知和响应系统通过最大限度地减少脱靶效应来确保高治疗特异性，因为治疗分子仅在工程细菌检测到疾病信号的部位产生。此外，由于效应蛋白的持续表达引起的高代谢负担会导致自发基因突变并降低细菌生长速度，这种情况在感知和响应系统中不存在，因为效应蛋白仅在响应感觉信号时产生。

具有感知和响应系统的益生菌主要通过检测病原体产生的群体感应分子并释放抗微生物制剂，实现靶向抗感染。 细菌释放的群体感应分子参与调节基因表达以响应细胞群密度的变化。这些分子通常是物种特异性的，因此是病原体检测的理想候选者。虽然抗生素可用于消灭病原体，但多重耐药菌株的出现使这些药物难以满足治疗需求。此外，由于抗生素的广谱性，通常会对微生物组的其他成员造成附带伤害，可能导致其他疾病和更高的易感性。

图2：感知及响应系统整合到细菌中实现疾病靶向治疗

Hwang等设计了EcN来检测由病原体铜绿假单胞菌产生的 N -酰基高丝氨酸内酯(AHL)。这一过程通过组成性表达转录因子LasR来实现，LasR与AHL结合并激活PluxR启动子，启动表达抗铜绿假单胞菌S 5pyocin、抗生物膜DspB酶和E7裂解蛋白，诱导EcN自裂解以释放治疗分子。这种工程微生物对小鼠和秀丽隐杆线虫都具有预防和治疗作用。同样，使用来自粪肠球菌的prgX/Q系统来设计乳酸乳球菌以靶向粪肠球菌，可以产生三种对病原体具有有效抗菌活性的细菌素。prgX/Q系统在病原体产生的信息素cCF10存在下被激活，从而能够针对性地检测和消除粪肠球菌，工程益生菌能够消除多药耐药的粪肠球菌菌株。霍乱弧菌和白色念珠菌也开发了这种感知和响应系统。

除了检测群体感应分子外，病原体特异性转录因子也被用于开发产生抗菌化合物的活细菌。 López-Igual等使用大肠杆菌β3914将工程化毒素递送到霍乱弧菌中。毒素被内含肽分开，因此它仅在携带特定转录因子的目标病原体中被激活，这确保了高特异性，因为宿主细菌和其他微生物都不会受到毒素-内含肽复合物的影响。作者证明了这种系统可用于专门针对斑马鱼幼虫和卤虫中的致病性和抗生素抗性霍乱弧菌的*伤杀**作用。

其他研究则使用疾病特异性生物标志物来开发感知和响应系统。Palmer等设计EcN以检测连四硫酸盐，这是一种在沙门氏菌感染期间存在于发炎的肠道中的化学物质，由活性氧与管腔内的硫代硫酸盐反应产生。作者将沙门氏菌中存在的参与连四硫酸盐检测和利用的ttr操纵子转移到EcN上。ttr操纵子与MccH47的产生相结合，MccH47是一种抑制沙门氏菌生长的小菌素。工程化的EcN能够检测环境中的连四硫酸盐并产生MccH47，从而在体外实验中抑制和竞争病原体的生长。

除了感染性疾病之外，具有感知和响应系统的益生菌也用于治疗其他疾病。酿酒酵母已被用于通过感知并降解细胞外三磷酸腺苷(eATP)来治疗IBD。eATP是嘌呤能信号通路的一部分，该通路有助于IBD病理进程。eATP能够增强促炎细胞因子的产生和效应T细胞活化，并抑制调节性T细胞反应。CD39可将eATP水解为AMP，引起免疫抑制。因此，作者通过定向进化天然的人类P2Y2受体在酵母菌中开发了一种高度敏感的P2Y2受体来检测eATP。这种受体的激活与ATP降解酶的释放相关联。该工程酵母菌能够抑制IBD小鼠模型中的肠道炎症，效果与各种不良反应相关的常规标准护理疗法相似。McKay等以EcN为载体，局部递送治疗分子靶向治疗克罗恩病。作者以一氧化氮(NO)作为疾病生物标志物，并将其检测与治疗性粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)和运动调节蛋白CheZ的产生相关联，使EcN在NO产生的部位积聚并产生治疗分子。

几项研究通过将感觉和报告模块整合到细菌中，开发了基于工程益生菌的生物传感器。 尽管这些实例尚未用于递送治疗药物，但可以将报告模块替换为治疗模块来实现，例如蛋白产生或产生特定化学物质的代谢途径。Lubkowicz等使用罗伊氏乳杆菌产生感知金黄色葡萄球菌的生物传感器，通过将金黄色葡萄球菌的agr群体感应(agrQS)系统应用于益生菌来检测金黄色葡萄球菌发病过程中产生的自诱导肽-I(AIP-I)。

Mao等对乳酸乳球菌进行基因改造，使其可通过产生一种杂合蛋白来检测霍乱弧菌的群体感应分子CAI-1，杂合蛋白包含识别来自病原体CAI-1的配体结合结构域和来自益生菌的天然信号转导结构域，能够检测受霍乱弧菌攻击的小鼠感染。Mimee等利用乳酸乳球菌检测血红素来诊断胃肠道出血，生物传感器包含细胞外血红素膜转运蛋白和血红素响应性转录抑制因子，配体存在时该因子抑制合成启动子。这种工程益生菌被整合到一个可摄取的电子设备中，该设备可以无线传输由乳酸乳球菌响应血红素产生的发光信号，实现原位监测。

五、靶向肿瘤缺氧的细菌

工程化细菌可以作为抗癌剂，其中合适的细菌菌株通过工程化改造以在缺氧的肿瘤环境中定殖，并提供治疗性有效载荷。 肿瘤缺氧是大多数实体瘤的共同特征，被认为是一种与健康组织相比组织氧水平降低的状态。例如，肾皮质中的氧分压(pO2)为37.6mmHg，而相应肾细胞癌的pO2仅为9.6mmHg。人体内的健康组织依赖于复杂的循环系统来维持适当的组织功能和活力，需要定期从血液中供应氧气和营养物质并排出代谢废物。肿瘤组织具有相同的代谢需求，但其氧气供应不足以支持其快速增长的肿瘤块。为了补偿这一点，肿瘤组织通过增强和不受控制的血管生成来加速其血管网络的发育。 最终在实体肿瘤中形成了一个混沌的异质性血管网络，产生了与血管系统距离增加、氧气水平降低的微区域。这种低氧微环境改变了肿瘤细胞代谢并导致细胞静止，有助于肿瘤细胞的治疗抵抗。此外，缺氧还可以调节和抑制肿瘤免疫微环境，促使肿瘤细胞逃逸免疫监视。

活细菌可以固有地定植于缺氧肿瘤区域。 在荷瘤小鼠中，静脉注射的细菌最初非优先地递送到健康组织和肿瘤组织，随着时间的推移，非肿瘤组织和循环中的细菌被迅速清除，而肿瘤中的细菌由于缺乏免疫监视能够大量繁殖。1891年，WilliamB.Coley首次使用野生型化脓性链球菌活性菌株治疗癌症，随后的报道表明， 双歧杆菌、梭状芽胞杆菌、埃希氏菌、李斯特菌和沙门氏菌属的许多细菌菌株可优先定植于实体瘤。 其中， 兼性或专性厌氧菌对肿瘤具有更高的特异性，并且不会定植于非肿瘤性缺氧病变区域。 有趣的是，据报道来自发芽梭菌的细菌孢子也可以靶向实体瘤。因此，此类细菌被认为是靶向肿瘤细胞的理想候选递送载体。

图3：基于活细菌的抗肿瘤递送系统

然而，靶向肿瘤细菌的安全性和内在毒性依然是一个问题，因为细菌是通过全身给药后到达肿瘤部位的。因此，在这些工程微生物系统中，通常选择厌氧菌作为底盘菌，因为它们不会在正常的有氧组织中定殖。 此外，通过基因改造降低了底盘菌毒性，并整合了增强抗癌效果的相应合成性特征。这些特征包括各种治疗性有效载荷，例如化学包被和负载的化疗剂或由宿主细菌通过整合到细菌细胞中的表达盒表达的核酸和重组蛋白。本文主要讨论肿瘤特异性递送的 1) 核酸，包括编码治疗性蛋白的cDNA作为DNA疫苗和用于RNA干扰的沉默RNA和 2) 重组蛋白有效载荷，包括细胞毒剂、前药转化酶、免疫调节剂和血管生成*制剂抑**。最后，简要总结不同靶向肿瘤的细菌的减毒方法(图3)。

1、核酸

治疗性cDNA和沉默RNA等裸露核酸穿过肿瘤细胞膜的渗透性有限，因此细胞吸收差，直接递送效率非常低。 为了增强核酸内化，基因疗法中已经探索了多种递送载体。 其中一种方法便是以活细菌作为载体将细菌质粒DNA转移到哺乳动物细胞中，这一过程称为细菌转染。 在癌症疗法中， 细菌转染可通过两种方式： 1) 递送编码治疗性蛋白的cDNA到肿瘤细胞，主动诱导细胞死亡； 2) 递送编码肿瘤相关抗原的cDNA到抗原呈递细胞，刺激抗肿瘤免疫响应。两种应用中，目标宿主细胞均需要内化载体细菌，其中细菌要么主动侵入癌细胞，要么被免疫细胞被动摄取。沙门氏菌属和单核细胞增生李斯特菌最适合细菌感染，并且已普遍用于癌症治疗。之前的一项研究中，将携带穿梭质粒的工程化单核细胞增生李斯特菌作为小鼠前列腺癌模型中的DNA疫苗，其中单核细胞增生李斯特菌细胞用肿瘤特异性抗原和前列腺特异性抗原(PSA)主动转染肿瘤细胞。工程化的单核细胞增生李斯特菌成功地引发T细胞特异性免疫反应，导致肿瘤消退。在另一项研究中采用了类似的策略，其中单核细胞增生李斯特菌被设计用于提供靶向黑色素瘤抗原基因-b(MAGE-b)的DNA疫苗，导致乳腺癌模型中的肿瘤消退。其他研究也使用鼠伤寒沙门氏菌和单核细胞增生李斯特菌菌株来递送编码血管生成*制剂抑**蛋白(如内皮抑素和内皮糖蛋白)的基因，以抑制肿瘤进展。

与DNA类似，siRNA和shRNA的递送也需要细菌载体主动侵入肿瘤靶细胞。 目前，细菌介导的RNAi递送已被用于小鼠肿瘤模型中多种基因的调控，包括IDO(免疫抑制因子吲哚胺2,3-双加氧酶)、PLK1(细胞周期相关蛋白，polo样激酶1)、STAT3、survivin和Sox2(性别决定区Y-box2)。除了沙门氏菌属和单核细胞增生李斯特菌菌株外，Xiang等报道了一种侵入性重组大肠杆菌BL21，可将shRNA递送到癌细胞中。工程化菌株表达来自单核细胞增生李斯特菌的侵袭素和李斯特菌溶血素O，使细菌能够浸润癌细胞并从吞噬溶酶体中释放靶向连环蛋白B-1(CTNNB1)的shRNA。连环蛋白B-1是一种已知的原癌基因，在多种癌症中发生突变或过表达。工程化大肠杆菌的施用导致结肠癌异种移植和正常肠上皮细胞中的连环蛋白B-1蛋白水平显着降低。当应用于APCmin小鼠（肠道和乳腺肿瘤发生模型）时，工程大肠杆菌菌株导致肠息肉数量减少80%。

2、治疗性蛋白

细菌介导的癌症疗法中，由直接靶向肿瘤的细菌表达和递送的治疗性蛋白主要分为细胞毒性制剂和免疫调节剂。 表达细胞毒性制剂是细菌表现高抗肿瘤活性的最直接方式，为了降低对健康组织可能的伤害，细胞毒素(如大肠杆菌溶血蛋白溶细胞素A(ClyA)和金黄色葡萄球菌α-溶血素)的表达需要严格控制以在肿瘤特异性条件下诱导产生。Ryan等设计了一种鼠伤寒沙门氏菌，可以响应缺氧环境并表达细胞毒性α-溶血素，成功减少小鼠乳腺肿瘤模型中的肿瘤生长。 除了可控表达外，细胞毒素也可以以肿瘤靶向嵌合蛋白的形式递送。 Quintero等报道了一种工程化鼠伤寒沙门氏菌，表达具有EGFR靶向配体的嵌合假单胞菌外毒素A，在体外实现了对肿瘤细胞的靶向*伤杀**作用。为了进一步验证，Lim等将工程化菌株应用于结肠癌或乳腺癌小鼠，并观察到肿瘤生长显着减少。在免疫调节剂中，肿瘤靶向的细菌已被改造为表达多种细胞因子，包括但不限于IL-2、IL-12、IL-18和鞭毛蛋白。应用这些细胞因子表达菌株已被证明可以调节针对癌症的免疫反应，使肿瘤微环境(TME)对免疫治疗敏感，并抑制肿瘤生长。两项独立的研究报道，工程化EcN用于递送针对PD-L1和CTLA-4的检查点阻断纳米抗体，以及针对免疫球蛋白CD47的纳米抗体拮抗剂。通过EcN递送这些纳米抗体导致肿瘤浸润性T细胞的激活增加，刺激肿瘤消退，并促进小鼠的长期存活。

除了能够直接干扰肿瘤的有效载荷外，肿瘤靶向细菌也被设计用于表达和递送前药转化酶。随着细菌的定位，无害的前药通过全身给药，并被定植于肿瘤中的细菌转化为它们的原始细胞毒性形式，进而最小化原始药物的脱靶活性。 胞嘧啶脱氨酶(CD)是一种正在使用的前药转化酶，可将5-氟胞嘧啶(5-FC，前药)转化为化疗药物5-氟尿嘧啶(5-FU，原始药物)。一项初步临床试验中，在三名难治性癌症患者瘤内注射表达CD的鼠伤寒沙门氏菌后，全身给药5-FC。六个治疗周期后，未发现关于工程菌的明显不良事件，在三分之二的患者中，观察到肿瘤内细菌定植，并且5-FU水平升高。该研究证明了通过前药和肿瘤靶向细菌实现化疗药物靶向递送的可行性。基于细菌递送的其他相关研究探索了来自单纯疱疹病毒的I型胸苷激酶/更昔洛韦、β-葡萄糖醛酸酶、羧肽酶G2作为特定前药的裂解酶的可行性，并在小鼠模型中获得了积极的结果。此外，Ho等设计了可以分泌重组黑芥子酶的EcN，将来自天然十字花科蔬菜中的芥子油苷转化为萝卜硫素(一种抗癌化合物)。在小鼠结直肠癌模型中，工程化EcN和西兰花提取物的共同给药导致显着的肿瘤消退，减少肿瘤的发生。

3、底盘细菌的优化

尽管多项研究证明了工程化细菌作为抗癌制剂的可行性，但需要进一步改进以降低用于靶向肿瘤的病原菌的毒力并减少其在体内的非特异性定植。 细菌和化疗药的联合疗法可以增强癌细胞对治疗的敏感性，减少两种成分的剂量，进而降低毒性和副作用。

尽管肿瘤靶向活性很高，但减弱毒力对于梭状芽胞杆菌、李斯特菌和沙门氏菌属的致病菌株至关重要，因为它们会引起感染。 这可以通过删除毒力基因或产生营养缺陷型突变来实现，使菌株无法自我分裂并引起感染。例如，脂多糖(LPS)是革兰氏阴性菌产生的最有效的内毒素之一，会引起系统性炎症。在鼠伤寒沙门氏菌中，编码用于脂质A生物合成的肉豆蔻酰转移酶基因msbB的缺失会导致产生的LPS中脂质A发生改变，从而减少细菌给药后小鼠体内产生的TNF-α(肿瘤坏死因子-α)的量。LPS修饰可以显著降低细菌的毒性，在小鼠中的LD50(半数致死剂量)增加了10,000倍。其他研究还报道了一种亮氨酸和精氨酸营养缺陷型沙门氏菌A1-R菌株，根据提高的LD50值，该菌株高度减毒，在各种模型中表现出高安全性。由于肿瘤微环境中富含亮氨酸和精氨酸，该菌株能够优先定植于肿瘤，增强肿瘤对化疗的敏感性。此外，常用的鼠伤寒沙门氏菌VNP20009是一种携带msbB缺失的嘌呤营养缺陷型突变体。该底盘菌已在各种小鼠模型中进行了广泛研究，并已通过临床试验的安全性评估。

另一方面，提高底盘细菌的肿瘤靶向特异性对于提高其作为治疗递送系统的性能至关重要。 这对于兼性厌氧菌尤其重要，包括沙门氏菌属、李斯特菌属和埃希氏菌属，因为这些微生物可以在正常的含氧组织中增殖并引起组织损伤。因此，增加兼性厌氧菌的肿瘤靶向特异性对于它们作为治疗递送系统的性能至关重要。 其中一种策略是通过在细菌表面表达肿瘤结合模块来增强细菌的肿瘤结合能力。 这些结合模块(合成性结合蛋白或天然细菌粘附素)通常靶向在癌细胞中过度表达的表面标志物，例如αvβ3整合素、硫酸乙酰肝素和肿瘤相关抗原。这些肿瘤结合模块的表面展示增加了细菌定植和肿瘤中工程化细菌的富集。

另一种策略是利用肿瘤特异性表达系统，以确保细菌介导的治疗递送的安全性。 这些系统中，有效载荷的表达受到诱导型启动子的调节，这些启动子能够响应TME信号，包括缺氧、酸中毒或直接递送至肿瘤部位的放射疗法。在其他研究中，研究人员还结合材料学和合成生物学来开发细菌介导的光热疗法用于癌症治疗。其中一些系统中，通过生物矿化将金纳米颗粒(AuNP)涂覆在细菌表面。这种细菌经过基因工程改造，可以热响应性的表达抗肿瘤分子。细菌给药并定植于肿瘤部位后，增加近红外(NIR)激光，进而杀死肿瘤细胞。在NIR照射下，AuNP吸收透皮光子并将其转化为局部热量，激活细菌中肿瘤抑制分子的表达，与产生的热量一起诱导细胞死亡。在光诱导下，大肠杆菌细胞与AuNP的生物矿化的应用已被证明可以在小鼠乳腺癌模型中表达TNF-α和在小鼠结肠癌模型中表达ClyA，从而导致显着的肿瘤消退。

六、基于细菌的药物递送颗粒

除了活细菌疗法外，细菌衍生的无染色体颗粒，如细菌幽灵(BG)、微细胞和膜囊泡(MV)也可以作为药物递送载体。 这些颗粒比细菌细胞小，其中一些达到纳米颗粒尺寸，几乎与纳米晶体(<100nm)相当。与相对均匀组装的纳米晶体和其他纳米材料相比，细菌衍生颗粒的组成和分隔化是异质性的。此外，由于缺少基因组DNA，这些颗粒无法复制，但仍保留部分细菌细胞结构和功能。

1、细菌幽灵(BG)

BG是细菌的空细胞包膜，可通过革兰氏阴性菌中的噬菌体φX174裂解蛋白E介导的温和裂解或革兰氏阳性菌中的化学还原策略产生(图4)。 来自革兰氏阴性菌的BG研究最为广泛。研究表明，革兰氏阴性菌中蛋白E的重组表达可诱导细菌细胞裂解和BG的产生，而其在革兰氏阳性菌中的表达会导致细胞死亡而不裂解。蛋白E是一种由91个氨基酸组成的多肽，可以寡聚化形成穿过细菌内外膜的跨膜通道。在电子显微镜下，蛋白质E介导的大肠杆菌裂解过程观察到直径从40到200nm不等的E裂解通道。在高分辨扫描电子显微镜下，在E裂解通道外观察到一个排出云，表明有细胞内容物快速排出。 有趣的是，E裂解通道融合了内外膜，从而密封了细菌的周质，因此，产生的BG不含细胞质成分，但保留了细胞形态和大多数表面结构，包括外膜和内膜，以及刚性肽聚糖层。因此，还保留了天然细菌的免疫原性元素，包括LPS、单磷酰脂A和鞭毛。 这些元素可被Toll样受体(TLR)识别，因此来自病原菌的BG也能够触发先天免疫反应。由于BG不具有感染风险，它们固有的佐剂特性使其成为通用的疫苗和佐剂候选物。此外，在细菌中表达的重组膜蛋白也与完整的膜结构一起保留在BG上。通过外源抗原蛋白与膜锚蛋白的重组融合，BG可以设计为在其外膜或内膜上表达选定的抗原蛋白。通过这种方式，BG可以作为载体将外来抗原传递给抗原呈递细胞，并刺激针对特定病原体的免疫反应。因此，这些重组BG作为针对更广泛的传染病候选疫苗的研究正在进行。

传统的细菌疫苗通常包含灭活或减毒活细菌，虽然前者更安全，但后者能够引发更有效的免疫反应 。BG提供了一种更安全、更有效的候选疫苗，因为它们不是非活细胞，但仍保持很高免疫刺激能力。目前，BG疫苗已经从许多主要的人类病原体中产生，例如肠出血性大肠杆菌O157:H7、鼠伤寒沙门氏菌、肠炎沙门氏菌、肺炎克雷伯菌、幽门螺杆菌和霍乱弧菌，并在几种动物模型中进行了评估。这些BG保留了高活性的免疫原性元件，并提供了针对致病性天然菌株的显著保护作用。此外，来自这些细菌的BG也在探索用于递送其他病原微生物的重组抗原。例如，表达衣原体主要外膜蛋白的霍乱弧菌BG在小鼠中成功地产生了针对鼠衣原体的保护作用。在其他研究中，BG也被设计用于递送模拟抗原。例如，来自大肠杆菌O157:H7的BG被设计为表达来自肠道病毒71和柯萨奇病毒(两种手足口病病毒)的嵌合病毒蛋白。在BALB/c小鼠中灌胃重组BG极大地引发了体液和粘膜免疫反应，产生了针对病毒和大肠杆菌O157:H7的特异性抗体。最近，Kim等开发了鼠伤寒沙门氏菌BG，递送了登革热病毒所有血清型的包膜蛋白结构域III。重组BG在BALB/c小鼠中诱导强大的IgG产生和T细胞介导的针对登革热病毒的免疫反应。

值得注意的是，基于BG的疫苗的临床研究依然缺失，大规模BG疗法的限制之一是难以大规模生产。 例如，φX174裂解蛋白E不必要的泄漏表达可能导致宿主细菌生产中的生物量减少，最终导致产生的BG减少。此外，革兰氏阳性菌的BG是通过各种化学试剂(如去污剂、强碱和强氧化剂)介导的温和细胞裂解产生的。在大规模生产过程中，此类化学品的使用和去除仍然是一个技术和经济挑战，需要在进一步应用之前解决。

图4：无染色体细菌颗粒

2、微细胞

微细胞是在异常细胞分裂过程中产生的纳米级细菌细胞(100-400nm)。微细胞继承了母体细胞的大部分细胞成分，并且包含完整的肽聚糖细胞壁、细胞膜、核糖体、蛋白质、RNA和质粒DNA，但没有染色体。因此，微细胞不能复制，但在微观上类似于正常细胞并维持大多数细胞功能(图4)。 微细胞于1930年首次报道，1967年命名，已被广泛探索作为研究细胞分裂、噬菌体感染、细菌化学感受器和膜转运蛋白的模型。微细胞具有作为替代疫苗和药物输送系统的巨大潜力。

在多种细菌物种中，操纵细胞分裂调节因子或Min系统可以诱导产生微细胞。 在大肠杆菌中，MinC、MinD和MinE三种蛋白协同介导细胞分裂隔膜的正确定位，其中原核同源微管蛋白FtsZ形成环状结构(Z环)并启动细胞分裂。 minCDE 基因的缺失会导致一些分裂细胞中无染色体一极的Z环错位，最终导致细胞分裂后形成微细胞。除大肠杆菌外，关闭Min系统还可以诱导枯草芽孢杆菌、谷氨酸棒杆菌、单核细胞增生李斯特菌、铜绿假单胞菌和鼠伤寒沙门氏菌产生微细胞。其中，单核细胞增生李斯特菌的微细胞产生量较低，可通过FtsZ的过表达得以提高。

由于具有高效的宿主先天免疫反应刺激能力，微细胞也被开发作为候选疫苗和佐剂。 微细胞优于BG，因为它们体积更小，具有完整的膜细胞功能，并且在革兰氏阴性和革兰氏阳性菌中都可以产生。BG和微细胞均存在表面抗原，后者还具有功能性分泌系统。III型分泌系统(T3SS)可将细胞内的细菌毒素递送给宿主以触发免疫反应。 考虑到与使用活病原体相关的安全问题，微细胞是利用T3SS进行抗原递送的不错选择。 Carleton等将T3SS整合到鼠伤寒沙门氏菌微细胞中，使其能够分泌含有来自单核细胞增生李斯特菌的免疫原性肽的异源融合抗原。用微细胞免疫Balb/c小鼠后，小鼠成功地引发了CD8+T细胞反应，并产生针对单核细胞增生李斯特菌感染的保护作用。这项研究表明，微细胞保留了其母体细胞的关键功能，并且这些遗传功能可以通过基因操作进行编程。

除了候选疫苗外，微细胞也作为纳米颗粒在各种研究中用于癌症治疗的药物递送容器。 MacDiarmid等报道了首次使用微细胞为癌症治疗递送化疗药物的广泛研究。通过删除Min系统，鼠伤寒沙门氏菌和大肠杆菌产生微细胞，通过顺序密度梯度离心纯化，并在最高浓度为5μg/5x108微细胞条件下通过扩散装载化疗药物阿霉素(Dox)。为了增强肿瘤特异性，微细胞还连接了靶向EGFR的抗体，产生EGFRminicellDox。然后将EGFRminicellDox用于携带人乳腺癌、白血病和卵巢癌异种移植瘤的裸鼠中，所有三种模型中都产生了显着的肿瘤抑制。有趣的是，微细胞的包装导致了Dox的肿瘤靶向递送和积累。在给予相同剂量的情况下，EGFRminicellDox比单独使用Dox产生更有效的肿瘤抑制。EGFRminicellDox的I期临床试验发现复发性胶质母细胞瘤(GBM)患者每周耐受剂量是5x109微细胞。此外，靶向EGFR的微细胞(产品名TargomiRs)被设计用于以0.3μg/109微细胞的浓度表达和递送肿瘤抑制microRNA(基于miR-16的模拟物)，用于治疗恶性胸膜间皮瘤(MPM)小鼠模型。在荷瘤小鼠中静脉注射包装的微细胞导致MPM肿瘤中的剂量依赖性生长抑制。此后，TargomiRs治疗的I期临床试验通过了安全性评估，发现患者可以耐受每周剂量5x109TargomiRs。另一项研究中，微细胞(产品名VAX014)表达来自假结核耶尔森菌的肿瘤渗透侵袭素和来自产气荚膜梭菌的生长抑制毒素perfringolysin O，单次膀胱灌注后，在小鼠模型中显示有效抑制原位浅表性膀胱癌的生长。I期临床试验目前正在招募患者，以研究非肌肉浸润性膀胱癌患者膀胱内VAX014滴注的安全性。这些研究证明了使用微细胞作为药物递送系统的安全性，并可能促进该领域的进一步临床转化。

3、细菌膜囊泡

细菌膜囊泡(BMV)是细菌衍生的基于脂质的球形纳米颗粒，其尺寸比微细胞更小(20-400nm)。 自然界中大多数细菌都会产生BMV，它们可以运输各种货物分子，并在细胞间通讯中发挥重要作用。 根据囊泡膜的起源，BMV可分为外膜囊泡(OMV)、爆炸性外膜囊泡（EOMV）、外内膜囊泡(OIMV)和细胞质膜囊泡(CMV) 。典型的OMV通过革兰氏阴性菌的外膜起泡形成，并且富含周质蛋白。在源自噬菌体的内溶素存在下，肽聚糖层会发生降解，导致细菌细胞的爆炸性裂解，从而产生复双层OIMV和EOMV。基于多种细菌物种的研究发现OIMV专门包裹DNA，包括质粒和染色体DNA，而EOMV则包含任意的内容物。革兰氏阳性菌没有外膜层结构，因此通过内溶素介导的细胞鼓泡死亡产生CMV，其中CMV包含一系列细胞质内容物。

图5：细菌膜囊泡

鉴于基于脂质体的药物递送系统的最新进展，脂质纳米粒(LNP)和BMV作为药物递送载体引起了研究人员的极大兴趣。然而，对BMV生物生成的理解依然不足，进一步限制了其作为药物递送系统的应用。 目前，仍然难以对细菌进行工程改造以产生具有特定有效载荷的重组BMV。装载有效载荷的主要方法是通过有效载荷的重组表达或与有效载荷共孵育，增加母体细胞中的总细胞有效载荷浓度。或者，分离的BMV通过电穿孔、超声处理、去污剂或其他渗透增强剂装载有效载荷。 与化学合成的LNP不同，BMV可能携带来自母体细菌的大量内源性杂质，这些杂质难以去除，并且给药期间可能对宿主产生风险。更重要的是，同一细菌细胞在不同的生长阶段会产生不同内容物含量的BMV，目前的分离方法无法分离这些BMV。因此，通过超速离心从一种细菌菌株中分离出的BMV是杂合的，如果是致病菌株，通常含有毒力因子。另一方面，此类BMV杂质具有提供独特优势的固有特性。例如，来自益生菌嗜酸乳杆菌的CMV可以通过干扰素-γ介导的抗肿瘤机制显著抑制结肠腺癌小鼠模型中的肿瘤生长。来自其他益生菌乳酸杆菌菌株的CMV和来自共生EcN的OMV可以保留宿主菌株的免疫调节特性，且具有较低的免疫原性。 因此，来自益生菌菌株的BMV(包括来自乳酸杆菌属的CMV和来自EcN的OMV)正被开发作为更安全、免疫兼容的药物递送底盘细菌，因为这些BMV具有较低的免疫原性，并且显示出以其原始内容物含量产生的治疗效果。

由于工程化CMV的生产效率低、复杂性高，大多数研究都集中于使用OMV递送外源分子以达到治疗目的。 Gujrati等对来自减毒大肠杆菌K12的OMV进行工程化，通过表面表达HER2结合配体以靶向表达HER2的肿瘤细胞。OMV通过电穿孔装载治疗性siRNA后，全身性注射到荷瘤小鼠中，成功诱导靶基因沉默和明显的肿瘤生长抑制。另一项研究中，Gujrati等对相同的大肠杆菌菌株进行改造，以产生负载黑色素的OMV(OMVMel)，其光热转换效率达到18.65%。在小鼠模型中，静脉注射OMEMel导致黑色素生物聚合物在肿瘤中积累。使用黑色素生物聚合物作为光热反应的核心，通过光热疗法对肿瘤进行成像和消除。除了癌症外，BMV也用于治疗炎症性疾病。源自肠道共生多形拟杆菌的OMV被设计用于封装和递送重组人角质形成细胞生长因子2(KGF-2)，用于治疗小鼠模型中的结肠炎。OMV的包封能够在通过消化系统时稳定KGF-2。此外，在葡聚糖硫酸钠诱导的结肠炎模型中，口服OMV有助于缓解炎症引起的组织损伤，减少结肠萎缩，促进肠道恢复。

七、总结和展望

本文讨论了如何使用基于细菌的药物递送系统来靶向多种疾病治疗，这些系统通常比传统的药物递送方法具有独特的优势。借助基因工程手段，活细菌可用于将治疗性蛋白质或分子输送到胃肠道、口腔、鼻腔以及皮肤等人体不同部位。由于治疗剂的原位生成，这些治疗剂通常更容易给药并且可能比其他常规疗法具有更高的疗效。对这些药物递送系统的进一步改造，确保仅在疾病状态下发挥靶向活性，进而提高其安全性和有效性。此外，利用某些细菌的天然肿瘤定植能力，具有广泛治疗有效载荷的有效抗癌疗法具有可能性。最后，细菌衍生的无染色体颗粒为高度可定制的、全身给药的药物递送系统提供了一个平台，特别是作为疫苗或佐剂疗法。

参考文献：

Haosheng Shen, Nikhil Aggarwal, Kwok Soon Wun, Yung Seng Lee, In Young Hwang, Matthew Wook Chang. Engineered microbial systems for advanced drug delivery. Advanced Drug Delivery Reviews 2022 , 187, 114364.

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