文 | 伍月浮禄
编辑 | 伍月浮禄
«——【·前言·】——»
尽管以前胎盘被认为是无菌的，微生物的存在仅与病理有关，但最近的研究表明这种假设可能不正确。一些研究人员认为胎盘中存在微生物群落，这对于帮助马驹适应子宫外的生活非常重要。
我们检查了 24 匹产驹母马的胎盘、羊水和脐血，以及马驹的颈静脉血。所有母马和马驹均健康，产驹正常。在大多数脐血样本中分离到一些细菌生长。从胎盘样本中提取细菌 DNA 并进行测序。最丰富的门是变形菌门和放线菌门。
«——【·简单总结·】——»
胎盘中微生物组的存在引起了激烈的争论。在之前的研究中，马羊水和脐血中细菌的存在与马驹的健康无关。本研究的目的是确定马胎盘中是否存在与羊水和脐血中相同的细菌。样本取自 24 匹临产母马和小马驹。
提取胎盘细菌 DNA，并使用 16S rRNA 测序鉴定微生物组。所有羊水样本均含有一些多形核细胞；从四个样品中分离出细菌。
分别在 18 份和 3 份脐血样本中发现需氧或厌氧生长。所以 24 个样本中的血清淀粉样蛋白 A 均 < 5 mg/L，总 WBC 在 2900 至 10,700/μL 之间变化，纤维蛋白原在 0 至 5.16 g/L 之间变化。
在颈静脉血中，所有24匹马驹的血清淀粉样蛋白A均<5mg/L，白细胞总数为3200至8100/μL，纤维蛋白原为0.44至4.42g/L。所有胎盘区域的细菌微生物群多样性在门水平上相似，但在属水平上有所不同；最丰富的门是变形菌门和放线菌门。
在健康马匹妊娠的胎儿室和胎盘中发现了细菌；我们既不能证明也不能反驳胎盘有自己的微生物组的假设。最丰富的门是变形菌门和放线菌门。在健康马匹妊娠的胎儿室和胎盘中发现了细菌。
我们既不能证明也不能反驳胎盘有自己的微生物组的假设。最丰富的门是变形菌门和放线菌门，在健康马匹妊娠的胎儿室和胎盘中发现了细菌，我们既不能证明也不能反驳胎盘有自己的微生物组的假设。
«——【·简介·】——»
流产或在新生儿期需要持续关注的病弱小马驹的出生，给马匹养殖业带来了经济负担 。马胎盘的健康可能与这两种现象有关。
在之前的一项研究中，表明很大一部分患有子宫内膜炎的母马产生了受损的马驹，而在另一项研究中，发现健康新生马驹的羊水和脐血中存在活细菌。
尽管有大量关于健康和胎儿中存在微生物组的出版物，但人类胎儿室中是否存在微生物组或微生物群仍然存在争议。不健康的妊娠。
不同研究的方法差异很大，因此很难得出有意义的结论。在动物中，只有少数研究调查了胎儿室中的微生物群，例如马羊水中的微生物群。
在马驹排出的胎便中检测到细菌，表明定植在子宫内就开始了。最近的一项研究，其中对早产和产后胎盘样本进行了 16S rRNA 测序，表明细菌可能存在于健康的马胎盘中。微生物群转移到怀孕子宫的机制仍不清楚。
在 Hemberg 等人之前的一项研究中。无论马驹的健康状况如何，在羊水和脐血等胎儿室中都发现了细菌。在对人类、牛、犬和鼠等其他物种胎盘的研究中，健康个体中的细菌已被鉴定为正常微生物群/微生物组，尽管一些医学研究人员认为细菌是污染物。
我们的假设是马胎盘确实有自己的微生物组。本研究的目的是（i）对羊水和脐血中的细菌进行分型；(ii) 确定是否可以使用 16S rRNA 测序在马胎盘的三个不同位置检测到相同的细菌或其他细菌。
«——【·材料和方法·】——»
1. 动物
2017 年产驹季节期间，从匈牙利利比扎马场的 24 匹产驹母马中采集了样本。这些母马的年龄为 6-21 岁；所有繁殖群体都有代表。所有病例均自然分娩。这些母马在其他母马中产驹。
分娩后，母马和刚出生的小马驹被马夫带到一个单独的盒子里。记录怀孕时长、站立和哺乳时间、产后并发症、马驹的健康状况以及产驹和胎盘排出之间的时间。
2. 羊水
当羊膜囊清晰可见时采集羊水；最低点用70%乙醇擦拭3次。使用无菌 18 号针头将样品吸入 20 mL 注射器中。将两份羊水放入塑料管中进行细菌学培养和细胞学检查。样品被冷藏直至被运送到实验室。
3. 脐静脉血
小马驹出生后，距自然断点10cm以上处用70%乙醇清洗脐静脉上方脐部3次，并用无菌注射器和18G针头吸出20mL血液。穿刺后脐部组织内可见小血肿。
将一份血样收集到装有乙二胺四乙酸的试管中用于血液学检查，将一份血样收集到装有柠檬酸钠的试管中用于纤维蛋白原分析，它们被冷藏直至运输。
另外一根血清管充满血液并以 1000× g离心取样后 30 分钟内持续 15 分钟。将分离的血清移入塑料冷冻管中并冷冻以用于随后的血清淀粉样蛋白 A分析。对于需氧和厌氧血液培养，将 3 mL 血液添加到两个装有血液培养基的玻璃瓶中。
4. 胎盘样本
记录产驹和胎盘排出之间的时间。当胎盘排出时，母马和小马驹已被转移到一个单独的干净盒子中。将胎盘放置成“F”形并检查其完整性和任何病理结果。胎盘处理过程中未使用任何消毒剂。
使用无菌剪刀从以下区域采集糖块大小的样品：（1）羊膜囊附着处的脐带；(2)颈星，来自彼此相对的两个部位；孕角，中部。将样品冷冻在 Tris-EDTA缓冲液中。
5. 小马驹的颈静脉血
分娩后 20 分钟至 80 分钟从马驹的颈静脉采集血样。将血样收集到EDTA管中用于血液学检查和柠檬酸盐管中用于纤维蛋白原分析；将它们冷藏直至分析，另外一根血清管以 1000× g离心15 分钟。将分离的血清移入塑料冷冻管中，然后保存在-20°C直至SAA分析。
«——【·样品处理·】——»
1. 羊水的细胞离心涂片制备和临床化学
细胞离心涂片制备和临床化学分析在布达佩斯兽医大学临床化学实验室进行。样本被运送到实验室，并在隔热箱中冷藏。使用 Advia 120 血液分析仪利用马的特征进行血液学分析。使用KC4凝血分析仪使用Dia-FIB试剂测量纤维蛋白原。
通过显微镜评估细胞离心涂片制剂中的总数，包括上皮细胞和白细胞。同一临床病理学家评估了所有样本。
样品的细胞学评估是通过 May-Grunwald-Giemsa 染色后对细胞离心涂片制剂进行显微镜检查来手动进行的。
细胞总数由经验丰富的细胞学家半定量测定，并报告为低、中、大或非常大。计算不同细胞类型的百分比。PMNL 的比例按以下类别报告：0%、1-14%、15-29% 和≥30%。
2. DNA提取
切下胎盘碎片，置于无菌 15 mL 离心管中，并在无菌 DPBS中洗涤两次。使用无菌手术刀片在冰上的一次性培养皿中将样品切成小块。按照制造商的说明，提取 DNA 。
使用 NanoDrop 8000 分光光度计测试 DNA 的数量和质量，所有样品在 260 和 280 nm 处的吸光度比在 1.75-1.90 之间，纯化的 DNA 样品在测序前储存于 -80 °C。
3.细菌 16S rRNA 测序
提取的 DNA 样本被送往乌普萨拉 SciLife 实验室的国家基因组基础设施实验室进行文库制备和测序。使用 16S Ion Metagenomics Kit™使用引物组 V2、V4、V8 和 V3、V6-7、V9 通过两个单独的 PCR 反应扩增 16S 区域。
通过 qPCR 估算样品的细菌 16S 含量，然后对样品体积进行归一化以用于文库制备。根据制造商的说明在 AB Library Builder System 上进行文库制备。使用 DNF-474 高灵敏度 NGS 片段分析套件，通过片段分析仪系统对最终文库进行评估和定量。
使用Ion 530芯片在Ion Chef系统上进行模板制备和芯片加载；测序在 Ion S5™ XL 系统上进行，遵循 Ion 520™ 和 530™ Kit–Chef 用户指南。
«——【·结果·】——»
1. 产驹
据罗斯代尔称，有二十四匹健康的小马驹诞生了。19 匹小马驹在 2 小时内得到哺乳；五匹马驹需要超过 2 小时才能站立和吃奶。母马的妊娠期长度在 311 天到 341 天之间变化所有母马的胎盘均在 3 小时内排出。平均排出时间为 67 ± 36 分钟。
2. 羊水中的多形核白细胞
所有细胞离心涂片制剂均含有细胞，包括成熟鳞状细胞、角蛋白鳞片和 PMNL。所有羊水样本均含有一些 PMNL，大多数情况下观察到的 PMNL 数量较少至平均水平，而仅 5 个样本中观察到的 PMNL 数量较多。
PMNL 经常卷起且难以评估，因此无法评估是否存在任何细胞内细菌，甚至在某些情况下无法获得 PMNL 的确切数量。
3. 羊水和脐血的细菌学
大多数羊水样本不含细菌，而鲁氏不动杆菌、马链球菌亚种的纯培养物。四个样本中检出兽疫杆菌、粪肠球菌或凝固酶阴性葡萄球菌，例如木糖葡萄球菌。其余两个样品产生混合生长，被认为是污染，因此不进行进一步分析。
4. 胎盘区域的分类组成
所有胎盘区域均鉴定出 20 个门。变形菌门、放线菌门、厚壁菌门和拟杆菌门是 CS、PH 和 UC 样品中的主要门。在属水平上，OTU分别被分配到CS、PH和UC区域的469、427和527个不同属。
从每组中确定的 10 个最丰富的细菌属中，我们观察到鞘氨醇单胞菌属占主导地位，丰度为 3.39%，其次是副球菌属、黄体单胞菌属、棒状杆菌属。和糖多孢菌在CS 组。在 PH 组中，最丰富的属是鞘氨醇单胞菌属、棒状杆菌属、副球菌属、德沃氏菌属 和平面微生物属。
我们注意到所有胎盘区域细菌门的总体组成相似，但在属水平上观察到 UC 样品中微生物群落丰度的显着变化。
«——【·讨论·】——»
本研究的目的是检查健康马驹的羊水和脐血以及正常马胎盘中存在微生物组的可能性。所有马驹的产驹后参数均健康，例如能够在 2 小时内站立和哺乳，并且 SAA 值≤ 5 mg/L 。
SAA 是监测非特异性炎症反应发生的有用工具，在健康个体中较低，但在炎症反应中迅速上升。对于 SAA 水平正常的马驹来说，白细胞计数较低并不表示患病。
大多数马驹的白细胞计数为 5482–6264/μL 血液，这被认为是正常的，尽管有六匹马驹的 WBC 计数为 3200–4900/μL 血液。只有五匹小马驹需要站立超过两个小时；总共 79% 的人能够在两小时内站立和哺乳，这被认为是正常的围产期行为 。
在这项研究中，通过培养对羊膜和脐血样本进行细菌学检查。仅 4/22 的羊膜样本中发现细菌生长，细菌是葡萄球菌，马亚种 兽疫弧菌和耳鼻喉科。粪肠球菌。
羊水中中性粒细胞含量高的母马可能通过先天免疫系统对病原体做出反应，或者这些中性粒细胞可能是哨兵。在一个样本中，发现了细胞内细菌，正如我们之前的研究中所观察到的那样。
发现的少数细菌可能反映了尝试培养细菌时遇到的问题；并不总是能够为所有细菌的生长提供正确的培养条件，特别是在不知道可能存在哪些细菌以及某些细菌在其他细菌存在的情况下生长受到抑制的情况下。
在临床兽医微生物学实验室中尤其如此，其中培养通常用于检测病原体，而不是发现实际存在的细菌。这些困难可以通过使用不依赖于首先培养生物体的鉴定方法来克服。
我们对羊水和脐血的结果与他们的发现一致。我们不能排除污染的可能性，即使我们小心地以无菌方式收集样品。
细菌有可能从组织表面转移到羊水中，正如关节内操作中所发生的那样。在这种情况下，人们可能会预期不止一种或两种细菌会从组织表面转移到液体中。为了支持我们的发现，其他人提出胎儿在子宫内持续定植，来源之一是羊水。
«——【·结论·】——»
在这项初步研究中，从正常足月马妊娠的羊水和脐血样本中分离出细菌。从同一匹母马的胎盘中提取 DNA，然后进行 16S rRNA 测序，从而鉴定出多个细菌群落。
剖腹产期间获得的样本与其他物种中发现的微生物组有相似之处。观察到的大量细菌表明大多数细菌可能是污染物。在不同的胎盘区域发现了不同的细菌，这种定位似乎不太可能是由于污染造成的，我们既不能证明也不能反驳胎盘有自己的微生物组的假设。
«——【·参考文献·】——»
【1】麦克利，《马中晚期妊娠流产相关原因和综合征的全球分布进行范围审查》，南加州大学出版社，2014年。
【2】范赫勒，《马健康和疾病中的血清淀粉样蛋白 》，华盛顿大学出版社，2011年。
【3】亨伯格，《健康怀孕期间子宫内的细菌群落》，耶鲁大学出版社，2010年。