大鲵选育研究和病毒疫苗研发

文|博文致语

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前言

大鲵俗称娃娃鱼,为我国特有,故又有中国大蛻之称,隶属于两栖纲、有尾目(阮Q〃e),隐鯉蛻科,是现存两栖动物中较为原始的种类之一。大鲸分布于我国陕西、甘肃、山西、河北、河南、青海、四川、重庆、贵州、湖北、安徽、江苏、浙江、江西、湖南、福建、广东、广西18个省市。

大鲵选育研究和病毒疫苗研发

大蛻素有活化石之称,它是一种集科研、观赏、药用与美食为一体的特种经济动物。大蛻具有极高的经济价值:蛻皮极为柔软,是一种优于鳄鱼皮的良好皮革;蛻胆可解百毒,清热明目;蛻肉含有8种人体必需的氨基酸,氨基酸总含量为91.92%,必需氨基酸含量为39.6%,营养价值高于牛肉、鲍鱼。

其肉质细嫩、风味独特、营养价值极高,其肉蛋白中含有17种氨基酸,其中有8种是人体必需的氨基酸。大蛻是一种传统的名贵药用动物。据《本草纲目》记载, 大蛻对贫血、霍乱、痢疾、冷血病、肾虚、小儿厌食、妇女经血不调均有显著疗效。

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近年来由于环境污染、人为捕捉、*私走**、贩运等造成大蛻资源遭到毁灭性破坏,种群数量迅速下降乃至濒危或灭绝,野生中国大蛻资源在我国已遭到极严重的破坏。联合国濒危野生动植物贸易公约组织已列入濒危动物保护名录,我国于1989年列入国家II级重点保护野生动物。开展大蛻人工养殖及繁殖研究是保护该物种的重要手段。

国内外同类研究的动态

1、大蛻种群资源调查与遗传学基础研究

我国对大蛻的研究具有悠久的历史,对大蛻的地理分布、形态特征、生活习性及食用和药用价值等,早在《山海经》、《史记》、《本草纲目》、《康熙字典》等诸多古籍中就有详细的记载。20世纪以来关于大蛻的研究大致可以分为2个时期。第一个时期是在70年代前,主要是对大蛻的生态分布和统计等宏观方面进行研究。

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第二个时期是在70年代后,由于野生大靦资源锐减,研究者开始从大蛻的繁殖生物学进行详细的研究,并陆续开展大蛻的生态养殖、人工繁殖、遗传进化的研究。进入21世纪,研究者开始对大蛻的医用、药用、食用和观赏等方面的重要经济价值展开详细的研究。新近关于大蛻的研究主要集中在种群分布和生态保护、胚胎发育和生殖系统结构及受精过程、生理生化、遗传学基础性研究等方面。

大蛻种质资源研究。在20世纪80年代以前,对大蛻的资源量的调查主要是以大蛻产地的收购量。后来逐步发展到对大蛻原有产区进行考察,通过走访和实地调查了解野生大蛻资源量相关信息。

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传统的大蛻资源调查统计方法是釆用“弓钩连续捕捉法”和“徒手连续捕捉法”。最近的研究表明大蛻体细胞中期分裂相染色体的数目为2n=60,但文献中未提及实验动物的性别。已有的研究表明大部分的两栖动物并不存在体型各异的性染色体,性染色体处于性别进化的初级阶段。

同时研究表明温度、湿度等环境因素对两栖动物性别分化存在很大的影响。对于大蛻DNA的研究可见两类,一是研究细胞核里DNA序列,一是研究线粒体里的DNA序列。这些研究主要通过物种间或DNA序列的比较,讨论大蛻在动物系统演化中的地位。对中国大蛻线粒体DNA的研究表明,大蛻线粒体DNA的全序列的长度为16503bp,包含编码13个蛋白质的基因,并与8种脊椎动物同种蛋白质序列进行了比较研究。

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研究表明复杂的两栖动物系统进化的突破,有待于蛙类和蚓蜡类等关键物种的线粒体基因组核昔酸全序列数据的获得。近年来运用分子生物学技术对于大蛻物种内部不同种群进行研究逐渐增多。

运用同工酶电泳技术和mtDNA序列分析技术对不同种群的研究表明,在所选取的6个种群的大蛻中,安徽黄山大蛻种群具有特殊的遗传特征,同时研究进一步证实了黄山大蛻种群与其他种群间存在着较明显的遗传差异。但大蛻种群分布及遗传特征与河流系统地理分布的关系没有得到详细阐述,这可能是人为导致大蛻的地理上的重新分布。

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形态学水平与分子水平相结合方法来研究物种遗传多样性已成为研究种群多样性的重要手段。已有学者对来自长江流域和黄河流域的不同地域的大蛻的种群进行了研究,他们釆取对线粒体DNA进行比较及核基因组DNA进行RFLP.RAPD等分子标记技术的微观研究和形态学的宏观数据等多种指标相结合,来研究大蛻种群内多样性及其与相近物种的进化关系。

从保护生物学的角度来对不同地方种群进行比较研究, 探讨大蛻的进化途径、分化和发生中心以及不同地方种群间的遗传差异等基本问题 ,这些信息将有助于大蛻人工繁殖中避免*亲近**繁殖,科学制定保护对策

大蛻良种选育技术研究

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我国从上世纪70年代始开展大蛻人工繁育研究工作,目前已经初步解决了人工驯养繁殖技术难题,但是人工繁殖中雌雄性发育不完全同步,雌性发育差,雄性大蛻的精子活性不高,催产率、受精率和孵化率偏低等问题同样还制约大蛻养殖的发展。

进入本世纪后,国内学者利用同工酶、线粒体DNA和微卫星等分子标记技术对大蛻的种群动态和进化历史、遗传变异和种群遗传结构进行研究,为大蛻保护遗传学研究奠定了基础。另外有学者通过大蛻与人工繁殖后代的遗传多样性研究,并结合目前大蛻人工繁殖的现状,提出了避免近交衰退的建议。但是仍然缺少大蛻苗种繁殖的技术标准和良种选育的指导方法。

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据有关部门测算,我国大饒存在总数量在100-150万尾之间。2004年娃娃鱼人繁试验中成功孵化出幼苗12000尾,这是国内29年来娃娃鱼人繁技术的一点突破。由此可见,娃娃鱼人工繁殖技术至今还处在试验阶段,娃娃鱼人工繁殖成功以后至今仍未突破大量产苗的技术瓶颈,严重地影响了娃娃鱼产业化进程,其资源难以得到保护与增殖。目前,国内大蛻的年产量不足200吨,苗种的年产量为70万尾左右,且有一定浮动。大蛻繁殖率低,每组亲本产苗不足200尾。

大蛻病毒病诊断及病毒疫苗研发

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鱼类及水产动物病毒学研究有实质性的进展是始于20世纪60年代,在建立鱼类细胞培养技术及鱼类细胞系之后;90年代之后,借助生物电镜、分子生物学及分子免疫学技术方法,在水生动物病毒病原的分离鉴定、基因组序列、结构蛋白、单克隆抗体、ELISA和PCR检测等方面有了长足进步。

同时,在一些发达国家,继减毒疫苗、灭活疫苗、亚单位疫苗和重组多肽疫苗之后,研发出鱼类病毒DNA疫苗。2005年,饒鱼传染性造血器官坏死病病毒DNA疫苗APEX-IHN分别在美国和加拿大获准上市[Saloniusetal]。

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近些年,人们利用基因芯片技术,分析编码传染性造血器坏死病病毒(IHNV)和牙鲜鱼弹状病毒(HIRRV)的糖蛋白DNA疫苗,分别免疫虹鱒与牙鲜后的基因表达差异,研究鱼类病毒DNA疫苗免疫保护作用。

大靦对水质要求甚高,它要求水体清凉清澈 ;水温长年保持在8-24C为宜;水质要求富含矿物质水,碱度、硬度适当偏高,石灰岩地区水最好,总碱度100-150mg/L,总硬度100-200mg/L,且Ca2+:Mg2+约为3:1。大蛻对碱性水特别敏感,pH>9造成死亡,pH6.5-7.4为宜。

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加强管理,控制和消灭病原

在现有的条件下,要消灭一切病原体尚不可能,只有改进饲养管理技术,尽量减少各种病原体的进入,才是防治病害的根本措施。

大蛻是一种有领地概念的生物,不是从小一起长大的大蛻,切勿轻易同池。更忌大小混养,以至误食。平时温顺的大蛻一旦发生打斗,双方异常凶猛,流血断足,在所难免。受伤以后,病原侵袭的机会倍增。因此需分级分池饲养。

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随着大蛻资源的减少,要想从同一地点、同一时间引进足够的亲本或已经非常困难。同一养殖场不可避免引进不同地域、不同规格大蛻,这些不同来源的大蛻势必带来一些不同的病原,如果直接放入养殖区,可能导致新病的流行。因此,新进的大蛻必须经过严格的消毒、隔离措施,确信没有问题,方可进入养殖区。

隔离时间1周左右。常用二漠海因、NaCl、高镒酸钾、抗生素等刺激鲜活饵料:新进的鲜活饵料(如:春片鱼种、虾、蟹等)都应经过暂养,确信健康无病方可使用。每次投喂之前,用O.3mg/L的二漠海因或lmg/L的C102浸泡15min后,捞出,用清水冲洗,再分池投喂。

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各种动物内脏、肉块:投喂这类饵料,首先必须确定其来自健康无病的动物;第二,要保证新鲜,任何腐败、变质的食物均不得投喂;第三,投喂前用50g/L食盐水浸泡20min,清水漂洗后投喂。

死饵、剩饵:大蛻以肉食为主,各种食物蛋白含量都高,死去的鲜活饵料和未吃完的剩饵,都易迅速腐败变质,成为细菌等病原生物的温床,这样既败坏水质,又容易被大蛻误吞致病。每天上、下午,养殖人员都应结合巡池、投食,捞尽死饵、剩饵。

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小结

每半个月对所有大蛻养殖池用二漠海因、高镒酸钾或抗生素消毒1次(因大蛻多在室内养殖,空气流通不是很好,最好少用CI02等产生刺激性气体的消毒剂),杀灭水体中的病原,发现有寄生虫,要考虑使用杀虫剂(如:优马林等)。

投喂药饵不能与水体消毒同时进行,因水体消毒对大靦吃食有影响,要间隔2-3do将要投喂的药物溶为水剂(本身是水剂最好)注入鱼块、肉块中做成药饵,药量应根据不同使用条件灵活控制,投喂药饵前停食卜2d。

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