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茶,种类繁多,富含多酚、多糖、氨基酸、维生素、皂苷、生物碱等,具有抗氧化、抗病毒、降糖降脂等功效。金花茶(Camellia nitidissima C.W.Chi),其叶性微苦、涩、平,与茶、山茶等同属于山茶科山茶属,目前已经从金花茶中鉴定到400多种化学成分,是所有茶叶中含皂甙和黄酮最高的物种。 因其特有的金黄色茶花和极窄的生长区域被列为国家一级保护植物和植物界的“大熊猫”。

于2016年被列入DBS 45/033—2016《广西食品安全地方标准》成为国家新资源食品、药食同源植物,且金花茶还被评定为药食花、叶高产型等多功能药食同源花卉。在民间人们不对花和叶的功效做过多区分, 多用来泡茶、煲汤和制作茶酒饮料,为广西传统药用植物及壮族传统民间用药。

《广西壮族自治区壮药质量标准》(第二卷)记载,金花茶叶具有清热解毒、利尿消肿作用,主治肾炎、水肿、咽喉炎、痢疾、高血压等病症。体内外药理研究证明金花茶具有抗氧化、抗肿瘤、降脂降糖等多种功效,具有极高的药食同源和经济价值。 而金花茶的花在近几年的研究中也被发现具有60多种活性成分,包括儿茶酚、天然维生素E等。

目前市面售卖和使用的多为金花茶的花,但被列为国家新资源食品的是防城普通金花茶的叶。从国家政策角度分析,能作为食品进行市场流通的是金花茶的叶, 花是否符合食品和用药标准,以及金花茶叶和花哪一部分的使用价值更高尚无定论。

针对这些问题,本研究选取在广西防城港市东兴市江平镇大坜村冲峰金花茶种植基地大规模田间种植的防普金花茶(Camellia niridissima Chi)、越南金花茶(Camellia insularis Orel et Curry)和大叶金花茶[Camellia chrysantha (Hu) Tuyama var.macrophylla S.L.Mo et S.Z.Huang]作为研究样本,拟采用超高相液相色谱法(ultra performance liquid chromatography,UPLC)。

建立防普、越南、大叶金花茶叶、花的化学指纹图谱,对叶和花2个部位化学成分类型及主要有效成分含量的差异进行定性和定量分析,为提升金花茶利用率、减少资源浪费、开发金花茶不同部位的药用食用功能、规范金花茶产品市场提供依据。

1 材料和试剂

1.1 材料

本研究所用防城港普通金花茶、越南金花茶和大叶金花茶均来源于广西防城港市东兴市江平镇大坜村冲峰金花茶种植基地,引种于2013年,由原南宁市金花茶公园基因库主管黄连冬高级园林工程师鉴定为山茶科山茶属金花茶组植物。2019年1月,项目主要基于金花茶叶片表型性状差异对植株进行挂牌,本研究从所挂牌的植株中分别选取防普金花茶5株(编号为FP1-29、FP1-41、FP1-42、FP3-57、FP3-95)、越南金花茶5株(编号为YN3-22、YN3-26、YN3-40、YN3-44、YN3-48)、大叶金花茶4株(编号为DY3-02、DY3-03、DY3-17、DY3-19)进行实验。

采集其新鲜的叶和花,放入-45℃速冻库,速冻2～3 h,速冻后放入45℃真空冷冻干燥机,干燥24 h,干燥后经粉碎机研磨,过药典3号筛备用。

1.2 仪器和试剂

Waters ACQUITY超高效液相色谱仪(Waters FIN样品管理器、QSM四元溶剂管理器、TUV检测器、Empower色谱工作站)(美国Waters公司);KQ-500E超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司);Milli-Q密理博超纯水机(苏州赛恩斯仪器有限公司);LG-30 (30 m2)型辐射式冻干机(北京松源华兴科技发展有限公司);BJ-150多功能粉碎机(拜杰仪器有限公司)。

50%乙醇(分析纯)、*腈乙**、磷酸(色谱纯)(四川省维克奇生物科技有限公司);实验用水为超纯水;对照品:绿原酸、表儿茶素、牡荆素、金丝桃苷、染料木苷、槲皮苷、木犀草素、山柰酚、二氢槲皮素、异槲皮苷(纯度98%,四川省维克奇生物科技有限公司);没食子酸(纯度98%,成都普非德生物技术有限公司);儿茶素(纯度99.2%)、芦丁(纯度91.7%)、水杨酸(纯度99.3%)、槲皮素(纯度99.1%)、芹菜素(纯度99.2%)(中国食品药品鉴定研究院)。

1.3 实验方法

1.3.1 液相条件和波长选择

选用色谱柱ACQUITY UPLC HSS T3 (100 mm×2.1 mm,1.8μm)。色谱条件:流动相为*腈乙**(A)-0.1%磷酸水溶液(B);柱温35℃,样品温25℃;进样体积0.1μL,双通道,以表1方法进行梯度洗脱。

根据全波长扫描,短波长和长波长所出的色谱峰具有较大差别,因在320和210 nm两个波长下,所出的峰基本可以囊括所有波长下所出的峰,且峰形较好,峰面积较高,故本研究最终选取这两个波长作为实验波长。

1.3.2 对照品标准溶液制备

对照品采用50%乙醇溶解后配制成5 mg/m L的母液。使用时将母液稀释成适当质量浓度的对照品标准溶液,各对照品进样质量浓度为:绿原酸0.050 mg/m L、表儿茶素0.100 mg/m L、牡荆素0.030 mg/m L、金丝桃苷0.100 mg/m L、染料木苷0.210 mg/m L、槲皮苷0.028 mg/m L、木犀草素0.030 mg/m L、二氢槲皮素0.100 mg/m L、异槲皮苷0.110 mg/m L、没食子酸0.043 mg/m L、儿茶素0.010 mg/m L、芦丁0.100 mg/m L、水杨酸0.100 mg/m L、槲皮素0.110 mg/m L、*奈山**酚0.036 mg/m L、芹菜素0.017 mg/m L。

表1 梯度洗脱程序

Table 1 Gradient elution program

1.3.3 标准曲线绘制

混合对照品标准溶液分别设0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2μL 7个进样体积,检测峰面积,以进样量为横坐标(X,μL),对应含量为纵坐标(Y),制作线性回归方程,测得各对照品线性范围。对照品线性回归方程的r2>0.999,标准曲线线性关系良好(标准曲线参数见表2)。

表2 各标准品回归方程及线性范围

Table 2 Regression equations and linear ranges of each standard product

1.3.4 待测样品提取和测定

精密称取0.2 g样粉,加50%乙醇10 m L,输入总功率为1300 W,频率为40 k HZ,温度为30℃,超声提取时间为30 min,定量滤纸过滤后,用0.22μm微孔滤膜过滤。与对照品标准溶液采用同样的色谱条件测定,计算已知化学成分含量。

1.3.5 数据处理

采用中药色谱指纹图谱相似度评价系统(2012版)进行评价,样品峰保留时间代表不同化学成分,根据样品峰与标准品峰保留时间的一致性确定是否为同一化合物,筛选不同品种金花茶不同部位共有峰和特有峰,计算相似度;通过样品峰面积计算化学成分含量,利用SPSS 23.0软件,对不同品种、不同部位化学成分含量差异进行比较,P<0.05差异有统计学意义。

2 结果与分析

2.1 金花茶不同部位UPLC指纹图谱比较及相似度检验

2.1.1 防普金花茶叶、花UPLC指纹图谱比较及相似度检验

采用中药色谱指纹图谱相似度评价系统将防普金花茶叶、花UPLC指纹图谱共有模式相结合,结果见图1和图2。根据评价系统的匹配数据,得到不同部位化学成分共有峰及特有峰。在波长为320 nm时,防普金花茶叶和花部位共有峰33个,分别为1～33号峰,花特有峰22个,分别为34～55号峰,叶特有峰21个,分别为56～76号峰。

在210 nm波长时,共有峰76个,分别为1～76号峰,花特有峰22个,分别为77～98号峰,叶特有峰25个,分别为99～123号峰。从不同波长来看,防普金花茶在210 nm波长时能检测到的峰比较多,且叶的特有峰要比花的特有峰多。

基于相对保留时间和峰面积对各化学成分进行分析,防普金花茶不同部位化学成分具有较大差异。在320 nm波长时,叶中化学成分较多,且峰面积普遍较高。在210 nm波长时,21 min前,花中化学成分峰面积较高,21 min后,两部分化学成分峰面积趋于接近。

在320 nm波长中,根据对照品保留时间,花和叶均含有的成分为异槲皮素、水杨酸、木犀草素、槲皮素,分别为17、21、25、26号峰。绿原酸、金丝桃苷、槲皮苷、芹菜素仅存在花中,分别为35、40、43、53号峰。没食子酸、二氢槲皮素、染料木苷仅存在叶中,峰号分别为57、66、68。在210 nm波长中,儿茶素、表儿茶素仅存在叶中,分别为100、101号峰。详见表3。

分别对防普金花茶叶、花的指纹图谱进行相似性检验,结果见表3。叶和花的相似度较低,分别为0.054、0.504。说明防普金花茶叶和花化学成分差异较大。

图2 防普金花茶叶、花210 nm波长时UPLC指纹图谱

Fig.2 UPLC fingerprint of the leaves and flowers of Camellia niridissima Chi at 210 nm wavelength

注:100-儿茶素,101-表儿茶素。

2.1.2 越南金花茶叶、花UPLC指纹图谱比较及相似度检验

采用中药色谱指纹图谱相似度评价系统将越南金花茶叶、花UPLC指纹图谱共有模式相结合,结果见图3和图4。根据评价系统的匹配数据,得到不同部位化学成分共有峰及特有峰。在波长为320 nm时,越南金花茶叶和花部位共有峰16个,分别为1～16号峰。

花特有峰33个,分别为17～49号峰,叶特有峰22个,分别为50～71号峰。在波长为210 nm时,两部位的共有峰72个,分别为1～72号峰,花特有峰34个,分别为73～106号峰,叶特有峰22个,分别为107～128号峰。从不同波长来看,越南金花茶在210 nm波长时出的峰比较多,花在两个波长中都具有较多特有峰。

表3 防普金花茶叶、花相似度检验

Table 3 Inspection of the similarity between leaves and flowers of Camellia niridissima Chi

图3 越南金花茶叶、花320 nm波长时UPLC指纹图谱

Fig.3 UPLC fingerprint of the leaves and flowers of Camellia insularis Orel et Curry at 320 nm wavelength

注:3-绿原酸,10-水杨酸,26-牡荆素,47-芹菜素,62-二氢槲皮素,63-金丝桃苷,64-异槲皮素,67-槲皮苷。

图4 越南金花茶叶、花210 nm波长时UPLC指纹图谱

Fig.4 UPLC fingerprint of the leaves and flowers of Camellia insularis Orel et Curry at 210 nm wavelength

注:109-儿茶素,110-表儿茶素。

基于相对保留时间和峰面积对各自化学成分进行分析,越南金花茶不同部位化学成分具有较大差异。在320 nm波长时,保留时间6 min以后,各部位化学成分呈现较大差异,叶中化学成分较多,但是花的峰面积较高。在210 nm波长时,保留时间7 min以前,两个部位化学成分类型没有太大差异,但花中的含量比叶高。7 min以后,各部位化学成分呈现较大差异,花中化学成分较少,但峰面积较高。

在320 nm波长中,根据对照品保留时间,花和叶中均含有的成分为绿原酸、水杨酸,峰号分别为3、10。牡荆素、芹菜素仅存在花中,分别为26、47号峰;二氢槲皮素、金丝桃苷、异槲皮素、槲皮苷仅存在于叶中,峰号分别为62、63、64、67。在210 nm波长中,儿茶素、表儿茶素仅存在叶中,峰号分别为109、110。详见表4。分别对越南金花茶叶、花的指纹图谱进行相似性检验,结果见表4。叶和花的相似度较低,为0.151、0.478,说明越南金花茶叶和花化学成分差异较大。