在阅读此文前，诚邀您请点点右上方的“关注”，既方便您进行讨论与分享，还能及时阅读最新内容，感谢您的支持。
后一种方法的假定的简单性允许我们处理不希望的抑制或变构相互作用旁边的酶和中间体不平衡。
但是以内在不稳定性为代价根据上述考虑，我们接下来展示了一些中等复杂程度的选择途径，它们说明了自下而上构建代谢的优势和挑战。
人工多酶网络可以通过使用未修饰的、天然存在的酶来构建，这些酶源自不同的生物体，然后被组装以允许它们执行特定的功能。
例如，非氧化糖酵解(NOG)循环包含八种核心酶，其中五种克隆自大肠杆菌，而关键的磷酸酮酶来自青春双歧杆菌 当结合时。
它们允许果糖6-磷酸(Fpk)完全氧化成理论最大量的双碳代谢物(即乙酰磷酸)，而没有以二氧化碳形式的碳损失。
以独立于ATP和氧化还原辅因子的方式NOG循环也可以与天然存在的核酮糖一磷酸循环结合形成甲醇缩合循环(MCC )。
其允许甲醇不依赖ATP和氧化还原平衡的化学计量转化为更长链的醇，例如乙醇和葡萄糖n-丁.其他人工多酶网络采用工程酶，赋予新的自然生化能力。
例如，报道的甲酰化酶途径通过对预先存在的苯甲醛脱氢酶使用RosettaDesign和基于Foldit的计算的计算蛋白质设计被用于修饰蛋白质活性位点并增加其对二羟基*酮丙**(DHA)的甲酰化酶活性。
然后利用工程酶组装五步线性途径，将三个一碳甲酸分子缩合为DHA，DHA可以很容易地磷酸化为糖酵解循环的DHAP。
戊糖-双歧-糖酵解循环包含多种来源于多种生物的酶(例如，大肠杆菌, 长双歧杆菌, 铜斑蛇, 嗜热脂肪地杆菌，以及乳酸乳球菌)并被设计成通过乙酰辅酶a将葡萄糖转化成聚羟基丁酸酯(PHB)生物塑料该循环使用复杂的净化阀来调节NAD(P)H水平，并防止NADPH的最终积累和随后的循环反馈抑制。
这种策略是必要的，因为戊糖-双歧-糖酵解循环产生的NADPH比生成PHB所需的要多。
清除阀由脱氢酶混合物组成，包括产生PHB合成所需NADPH的非突变型，其次是工程型，经过修饰增加了辅助因子对NADH的特异性。
工程化的脱氢酶与NADH氧化酶(即，NoxE)偶联以形成辅因子再循环系统，该系统即使在NADPH过量的情况下也允许持续的PHB生产。
巴豆酰辅酶a/乙基丙二酰辅酶a/羟丁酰辅酶A (CETCH)循环是另一个创造性的人工网络，其被设计和优化为将两个二氧化碳分子转化为一个乙醛酸或苹果酸分子，两者都是两碳代谢物在其最新版本中。
它由13个核心反应和17种酶组成，这些酶来自各种来源，包括细菌、古细菌、植物和人类该循环包括校正末端代谢物形成的酶、辅因子再生模块和工程酶(如甲基琥珀酰辅酶a氧化酶和丙酰辅酶a氧化酶)的校对，它们共同实现了持续的操作。
例如，级联反应的最初版本使用FAD依赖性甲基琥珀酰辅酶a脱氢酶，二茂铁作为电子受体，这被发现是阻碍连续操作的限速步骤；然而，活性位点的工程改造将甲基琥珀酰辅酶a脱氢酶转化为甲基琥珀酰辅酶a氧化酶，从而能够利用分子氧。
与此同时，malyl-CoA的积累表明了不必要的副反应，因此，通过添加用于校对的malyl-CoA硫酯酶来防止其积累。
除了中枢和/或生物技术相关的代谢反应之外，还使用自下而上的方法来组装磷脂生物合成途径，该途径基于能够将脂肪酸和甘油3-磷酸转化为不同磷脂种类该途径可分为两个主要阶段:脂肪酸前体转化为胞苷二磷酸二酰甘油的四步转化，然后转化为磷脂酰乙醇胺或磷脂酰甘油，这两者都是大肠杆菌膜。
磷脂酰甘油和磷脂酰乙醇胺之间的摩尔比可以通过改变各自酶的比例来调节，以获得模拟天然细菌膜的30∶70的磷脂混合物。
尽管可以随意组装代谢级联和酶工程的可能性，但上述系统仍然非常复杂，仅在潮湿的实验室中很难解决。
从逻辑上讲，计算建模可以用于辅助设计、预测性能和节省实验资源。
例如，稳健性分析的整体建模(EMRA)已被用于研究通过动力学扰动的路径的稳态稳健性，因为非稳态通常伴随着中间体的积累或消失，这导致不可逆的性能下降。
EMRA已被用于分析几种人工构建的代谢途径，包括NOG和MCC。
例如，该方法用于比较两种NOG构型，Fpk和木酮糖5-磷酸(称为Xpk)。
Xpk-only途径对酶浓度扰动更强，具有增加生产力的几个潜在过表达目标MCC的情况正好相反，因为只有61%的稳态约束集合模型保持稳定。
只有Fpk的配置进而导致所有模型的稳定状态，而采用1:3活性比的混合Fpk/Xpk的配置表现出99%的稳定性尽管EMRA在模拟过程中使用了连续生产模型，但它的预测也对应于批处理系统中较低的生产率。
事实上，批量MCC实验表明，较高的磷酸酮醇酶浓度导致较低的乙酸产生率，从而支持EMRA预测，并展示了识别可能对分叉敏感的酶。
前向工程方法也用于代谢途径的设计和优化结合实时在线质谱和连续系统操作的实验装置允许应用标准系统理论输入函数(例如常数、阶跃、斜坡、脉冲和正弦)和高时间分辨率监测。
然后将收集的信息用于糖酵解模型的参数化，以从葡萄糖产生DHAP或甘油醛-3-磷酸，包括11个机械酶促速率定律和60个动力学参数。
因为参数值未知，所以采用了逐步参数化方法，并使用该模型预测产物形成的最佳酶分布，以及昂贵辅因子如NAD的最小浓度。
这些预测随后通过随后的体外实验得到了证实。
将单个部分整合到更大的网络中是自然和人工系统中反复出现的主题，这使得复杂性和功能性的分层构建成为可能。
在创造功能化人工细胞方面的稳步进展也为更进一步设计多细胞系统提供了可能性。
将通信模块整合到其他沉默的结构中，将能够模仿自然多细胞系统的许多特征属性，例如分化和特化。
最终，这些发展将允许创造原始细胞网络，结果，观察突现行为。
自下而上合成生物中的当前通信机制是基于诸如DNA或小信号分子的分子消息的交换，尽管也已经提出了诸如囊泡融合和基于电压的通信的其他机制消息必须能够离开发送方，到达接收方，并触发响应。
这种情况由几个(可调的)物理约束来控制，例如介质和距离(影响扩散)、发送者和接收者对消息分子的渗透性以及分子的降解速率一种可能的信号分子是短单链DNA(ssDNA)，它本身可以作为信号，但也可以根据它们的序列编码额外的信息。
在最近的一个例子中，通过设计在装载有固定的标记ssDNA的蛋白质体之间的链置换系列，利用了这一特性。
当外部加入自由扩散和互补的ssDNA链时，蛋白体内部的荧光团可以被激活或淬灭。
同时，最初结合的互补ssDNA链可以被置换并作为连续的应答信号被释放蛋白质体膜的渗透性改变导致不同的信号速度，时空控制可以通过调节信号消耗、降解和再生速率这些结果使DNA成为研究通讯及其动力学参数的有吸引力和强大的信号分子，尽管未来的挑战将是如何将DNA信号耦合到代谢模块或TX-TL模块。
相比之下，在自然系统中用于通信的小信号分子不需要在合成通信的背景下广泛地重新利用。
它们在合成细胞系统中的应用特别相关，因为它可以与其他功能模块(代谢和TX-TL)偶联来触发接收器原始细胞的主要结构反应——就像在自然界一样。
一个特殊的例子依赖于膜通道α-溶血素，其表达可通过被动扩散转录因子启动，并在脂膜中自发聚集。
通透性的增加导致更多的转录因子进入受体原细胞，这反过来导致通道表达增加，但也导致释放或摄取更大的分子，否则这些分子不能通过膜扩散类似地，其它多肽孔，如蜂毒素，并且可以通过微流体装置或声阱在另一个显示小信号分子多功能性的例子中，通过产生AMP的发送体脂质体和含有糖原磷酸化酶b的受体脂质体证明了信号放大。
这种酶被AMP变构激活，当其酶活性与荧光NADH读数偶联时，AMP输入可被翻译成高达10当量的NADH输出。
另一种值得注意的原始细胞通讯方法是通过囊泡分裂和融合，其中信息首先通过信号囊泡(外泌体)的分裂离开发送者，并在融合后通过将其内容释放到接受者原始细胞中而到达接受者原始细胞。
人造外来体在这里只是作为一种运输工具来传递实际的信息。
这种机制的优点在于，在整个通信过程中，消息不受环境的影响。
然而，受控的囊泡分裂仍处于起步阶段，因此迄今为止仅实现了融合步骤及其等同变体。
上述通信机制可以应用于不同的通信架构，包括细胞内和细胞间以及原始细胞和天然细胞之间的混合通信。
虽然后者近年来已经获得关注，特别是在生物医学应用方面，我们在这里不详细讨论它，因为它建立在与纯合成细胞相同的原理上。
许多研究小组已经欣然接受了原始细胞内部交流的研究途径。
多泡囊泡和封装的凝聚层主要用于分离否则不相容的反应或通过分子拥挤加速它们，使这些结构让人想起细胞器，其信号和代谢物与周围的胞质溶胶交换细胞内通信的机制实际上与细胞外通信的机制相同，尽管它具有垂直而非水平的系统架构。
通道蛋白、离子和其他小信号蛋白的使用同样适用于细胞器然而，囊泡包囊方法背后的动机有很大不同。
尽管细胞间通讯的焦点在于所形成的等级相等的分布式原始细胞网络，但细胞内通讯的目的是将等级较低的实体，即合成细胞器，作为功能模块整合到整个原始细胞中。
参考文献
罗利埃，桑德马赫
《人工细胞的自下而上合成》