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防城金花茶(CamellianitidissimaChi)是指分布在广西防城地区金花茶的一个变种,其花产量高,是市场主流产品之一。目前对金花茶的研究主要集中在化学成分、药理作用、良种选育、栽培繁育技术等方面,对防城金花茶的研究也仅限于杂交育种栽培。关于防城金花茶表型与化学成分关联鲜有报道。植物形态特征和生长特性的改变是适应生存环境的表现形式,通过调节自身形态结构及生理特征来响应和适应环境变化。 前期研究表明,金花茶叶表型性状分化程度比较高,变异较为显著,遗传多样性丰富。

现防城金花茶种植面积达3300hm2,种植的金花茶种未经人工选育,存在种质混杂现象。因此,明确种质差异,对培育防城金花茶优良种质具有重要意义。金花茶生物学性状差异主要表现在株型和叶表型性状的差异上。表型性状是基因表达和环境修饰共同作用的结果,是植物遗传结构的直观反映,也是研究植物遗传多样性的传统经典方法, 因其直观、便利、成本低的特点,被广泛应用于植物种质资源评价。

本研究根据金花茶表型性状差异,从金花茶种植基地选择111株防城金花茶,采用超高效液相色谱(ultraperformanceliquidchromatography,UPLC)指纹图谱检测方法对金花茶化学成分进行分析,排除成分峰面积太低、检测不到或不具有检测意义,从获得的190个化学成分中筛选本研究条件能检测到的23个化学成分, 对防城金花茶化学成分差异及亲缘关系进行品质评价,其结果可为了解防城金花茶遗传特性及筛选优良种质提供参考和依据。

1材料与方法

1.1材料与试剂

金花茶种植于广西防城港市东兴市江平镇大坜村冲峰(108°7′43″E,21°38′40″N,海拔54.6m)基地,根据表型性状差异,选取111株进行挂牌。各植株分别命名为FP1-01～FP1-50、FP3-43、FP3-46、FP3-51～FP3-100、GFP01～GFP10。

*腈乙**、甲醇(色谱纯,赛默飞世尔科技中国有限公司);磷酸(色谱纯,天津市大茂化学试剂厂);无水乙醇(分析纯,成都市科隆化学品有限公司);咖啡碱、丁香酸、表儿茶素、牡荆素、二氢槲皮素、金丝桃苷、染料木苷、杨梅素、槲皮苷对照品(纯度≥98%,四川省维克奇生物科技有限公司);槲皮素对照品(纯度≥99.1%,中国食品药品鉴定研究院);木兰花碱对照品(纯度≥98%,上海源叶生物科技有限公司);齐墩果酸、19-去甲睾酮、秦皮甲素、原儿茶醛、大黄素、对香豆酸、马钱苷、去氧肾上腺素、阿魏酸、鞣花酸、没食子酸酯(纯度≥98%)、维生素B6(纯度≥99%)对照品(成都埃法生物科技有限公司);实验室用水为超纯水。

1.2仪器与设备

AR224CN十万分之一分析天平(奥豪斯仪器有限公司);WatersAcquity超高效液相色谱仪(配有WatersFIN样品管理器、QSM四元溶剂管理器、TUVDetector检测器、Empower色谱工作站)、ACQUITYUPLCHSST3色谱柱(100mm×2.1mm,1.8μm)(美国Waters公司);KQ-500E超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司);Direct-Q5UV密理博超纯水机(苏州赛恩斯仪器有限公司)。

1.3方法

1.3.1表型观察

2019年4月12日在基地进行,用卷尺等工具实地测量111株挂牌的金花茶植株株高、主干高、冠幅等,根据以上估算植株叶片数量和产量;采用冷冻干燥的方法,除去水分后称定,测定叶干重。直接观查叶片外观、形状、大小等表型性状,对各非数值型性状进行赋值处理,赋值具体见表1。

表1非数值型性状变量赋值表

Table1Non-numericalcharactervariableassignmenttable

注:/表示无此项,下同。

1.3.2样品处理

从挂牌的111株防城金花茶植株上,采集新发枝条上转绿成熟的叶片(平时用于商品出售的叶片),擦拭干净后,于‒40℃下速冻2h后,转入45℃升华干燥,干燥的叶片粉碎后过3号筛,装入干燥密封牛皮纸袋中,放入冰箱中冷藏备用。

1.3.3UPLC指纹图谱检测方法

(1)色谱条件

流动相为*腈乙**(A)-0.1%磷酸水溶液(B);柱温35℃,样品温25℃;进样量0.1μL;流速0.2mL/min;双通道,A通道25min至32min时段波长为260nm,其余时段波长为320nm,B通道波长为210nm;以表2方法进行梯度洗脱。

表2色谱条件

Table2Chromatographicconditions

(2)供试样品溶液制备

精确称取样品粉末0.5g,置试管中,加入25mL50%乙醇,40kHZ超声提取0.5h后,用定量滤纸过滤,滤液再次用0.2μm微孔滤膜进行二次过滤,即得待测液。

(3)标准溶液准备

对照品采用相应溶剂(根据溶解性选择乙醇、甲醇或水)溶解后制作成5mg/mL母液。用时将母液稀释成适当质量浓度的对照品溶液,各对照品进样质量浓度为:维生素B6 0.132mg/mL、去氧肾上腺素0.132mg/mL、咖啡碱0.180mg/mL、秦皮甲素0.096mg/mL、原儿茶醛0.206mg/mL、丁香酸0.0392mg/mL、马钱苷0.102mg/mL、表儿茶素0.100mg/mL、木兰花碱0.046mg/mL、对香豆酸0.114mg/mL、阿魏酸0.144mg/mL、鞣花酸0.024mg/mL、表儿茶素没食子酸酯0.110mg/mL、牡荆素0.030mg/mL、二氢槲皮素0.100mg/mL、金丝桃苷0.100mg/mL、染料木苷0.210mg/mL、槲皮苷0.028mg/mL、杨梅素0.110mg/mL、槲皮素0.110mg/mL、19-去甲睾酮0.176mg/mL、大黄素0.118mg/mL、齐墩果酸0.108mg/mL。

1.4数据分析

将叶形、叶基、叶尾、叶脉、细脉数、叶色、长势等非数值型性状进行赋值处理,对数量性状进行质量化处理,根据其平均值(X)和标准差(s)将供试材料划分为10级,从第1级[Xi<(X-2s)]到第10级[Xi>(X+2s)],中间每隔0.5s为1级,按照公式(1)依据每一级的相对频率计算多样性指数:

其中:H’为多样性指数,Pi表示第i个级别的出现频率,ln为自然对数。

所有数据进行标准化转换后,使用MSExcel2010统计实验数据,计算各性状的最值、频率、标准差、变异系数等;参考张辕的方法计算多样性指数;使用中药色谱指纹图谱相似度评价系统(2013.130723版本)进行化学成分分析;使用IBMSPSSstatistics23软件进行相关分析。

对照品分别设0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2μm7个进样梯度,测峰面积,以对照品浓度为横坐标,对应峰面积为纵坐标,采用MSExcel2010制作线性回归方程(r2>0.999),根据回归方程与样品峰面积,可计算得出各样品中已知23个化学成分的含量。

2结果与分析

2.1叶片表型性状多样性分析

防城金花茶表型性状分为非数值型性状和数值型性状。非数值型性状多样性分析结果见表3。由表3可知,防城金花茶叶片代表性状以长椭圆、叶基下延、叶尾渐尖、叶脉深、细脉数量中等、叶色绿、长势中等为主;7个非数值型性状中,各性状变异系数在57.330%～103.711%之间,总体变异程度均较大。多样性指数最高达到1.270,最低只有0.531,除叶基形、脉深浅、细脉数外,其他性状多样性指数值均大于1。综上可知,防城金花茶叶片表型性状在株系间的变异幅度大,离散程度较高,差异较大,群体叶片表型多样性较丰富。

表3非数值型性状多样性

Table3Diversityofnon-numericaltraits

数值型性状多样性分析结果见表4。叶片总数和产量变异系数分别为54.190%和57.140%,均高于其他性状,其离散度较高;叶长宽比和株高的变异系数分别只有10.607%和12.800%,离散程度小,叶片形状变化不大,植株长势比较均一。多样性指数从1.550～2.050不等,多集中在1.920～2.050之间,多样性指数平均值为1.909,各性状的多样性程度较大。

2.2叶片化学成分多样性分析

受试111株防普金花茶色谱峰数量、峰保留时间和峰面积均存在较大差异,各出峰类型代表图谱见图1。指纹图谱类型有3个,其命名为JHCFP1号的类型包含13株(GFP06、GFP08、GFP10、FP1-7、FP1-3、FP3-97、FP1-11、FP1-23、FP1-29、FP1-37、FP3-89、FP3-92、FP3-100),特征表现为13～29min出峰较多,且峰面积较高。JHCFP2号的包含94株(除FP1-5、FP1-10、FP1-24、FP1-26及JHCFP1号外的所有防普金花茶株系),为防普金花茶栽培种资源最多的品种,27min处有一含量较高的化学成分,10～19min处有较多出峰。JHCFP3号的仅有1株(FP1-5),区别于其他两个品种的特征为其在3～9min处有较多成分峰出现,其余出峰同品种1类似,本课题组研究表明,经测定其指纹稳定,可作为新的变异种质用于新品种选育。另有3株指纹类型不稳定,舍弃。

化学成分多样性分析结果见表5,各化学成分最小值为零,表明并不是所有株系均含该23个化学成分,每个株系所含的成分种类不尽相同;各化学成分的变异系数变化范围较大,从32.277%(19-去甲睾酮)到319.748%(表儿茶素)不等。维生素B6、19-去甲睾酮、二氢槲皮素、阿魏酸等的变异系数小,多样性指数较高;表儿茶素、金丝桃苷、表儿茶素没食酯酸、斛皮苷等的变异系数大,多样性指数低,说明该成分对于某个株系具有一定的独占性。相对于其他化学成分含量,马钱苷含量最大,但其变异系数也达到了110.733%,其数值波动最大。结果表明,111株防城金花茶叶片中所含有的化学成分各不相同,变异系数的变化范围较大,叶片差异大,遗传多样性丰富。

2.3叶片化学成分与表型性状主成分分析及相关性分析

以111株防城金花茶87种化学成分为原始数据,采用SPSS25.0数据分析软件对各化学成分进行标准化处理,再进行主成分分析,主成分分析结果见表6、7。由表6可知,以特征值大于1为提取原则,共提取到20个主成分,累积贡献率为81.550%,表明这20个主成分包含了防城金花茶各化学成分87个共有成分81.550%的信息,可以反映样品的主要特征,具有较好的代表性。根据20个主成分的因子得分,乘以相应方差的算术平方根计算出主成分的得分;利用每个样品各主成分得分乘以该主成分的贡献率(方差/20个因子的总方差)之和,计算各样品得分顺序,以评价样品基于化学成分含量指标的优劣,综合得分前10名的株系见表7。由表7可知,GFP07、GFP01、FP3-87、FP1-06、GFP09、GFP03、FP3-86、GFP05、GFP02、FP3-93的化学成分含量较高,若以化学成分的含量为评价指标,该10株较为优质。

表4数值型性状多样性

Table4Numericalcharacterdiversity

图1防城金花茶叶片UPLC指纹图谱类型

Fig.1UPLCfingerprinttypeofCamellianitidissimaChileaf

表5已知化学成分多样性分析(%)

Table5Diversityanalysisofknownchemicalconstituents(%)

表6主成分分析的特征值与方差贡献率

Table6Eigenvaluesandvariancecontributionratesofprincipalcomponentanalysis

表7基于峰面积主成分分析综合得分前10名的株系

Table7Top10strainswithcomprehensivescoresbasedonpeakareaprincipalcomponentanalysis

对23个化学成分与叶表型性状做相关分析,结果见表8。由表8可知,各表型性状中,叶尾形状及叶脉与化学成分的相关性较大;叶基形状与所有化学成分均无显著相关,叶形中与化学成分有显著相关的主要为矩圆叶和倒卵形叶,椭圆叶与所有化学成分均无显著相关,长椭圆叶仅与金丝桃苷具有显著相关;叶长宽比仅与牡荆素呈极显著相关;叶面积及叶柄长短与极少数指标呈显著相关。综上,选育与化学成分含量相关的品种,可主要考虑叶尾形状及叶脉2个表型指标。