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植物能够在自然环境中茁壮成长，微生物在其中起到了重要作用，它能够与植物建立有利的联系。这些微生物在一定程度上影响了植物的营养、生长速度、对生物和非生物压力条件的抵抗力，以及植物的生存和分布。这些生存在植物内部的微生物统称为内生菌，在长期的协同进化中，内生菌和宿主形成了互惠互利的关系。

内生菌不仅可以促进宿主的生长，也可以协助宿主抵抗环境压力，并且能够提高宿主竞争能力。有近30万种植物内部都拥有一个或多个内生菌，内生菌的种类众多，分布广泛，其群落组成受到多种因素影响，如地域、气候、组织部位、海拔、生长时期等。

由于植物组织的结构、成分不同，内生菌在宿主不同组织的群落结构也会产生差异。宿主的组织部位是内生菌群落结构的主要决定因素，产地和种类是次要的。Lycium ruthenicum Murr中根细菌群落多样性和丰富度程度，高于叶、花、茎。

水稻(Oryza sativa L.)中内生菌物种丰度和多样性显著低于根部内生菌；旱生灌木的根、茎、叶内生真菌呈现出更明显的组织特异性以及宿主选择性，叶与根的真菌群落多样性和组成结构低于茎(Wang et al., 2016)；人参(Panax ginseng)中的 Shannon指数表明根部内生细菌群落丰度最高,且根部 > 茎；Aquilaria malaccensis的内生菌物种在根系土壤和茎中分布均匀，茎的内生菌多样性高于根系土壤。

白木香[Aquilaria sinensis (Lour.) Gilg.属于亚热带植物，主要分布在我国南部地区，是我国生产名贵芳香类药材沉香的唯一植物来源，可用于生产熏香、香水、药物、心脏补品等高价值产物，从中提取的精油也具有抗菌特性。商业开发和过度砍伐正在导致这些树木资源不断减少，目前8种Aquilaria属的植物被列于《濒危物种国际贸易公约》(附录II)(1994)，并被国际自然保护联盟(IUCN，2009)列为易受伤害物种。

目前，关于内生菌促进沉香结香的报道中，促进结香的内生菌属主要为Aspergillus、Lasiodiplodia、Fusarium、Penicillium、Trichoderma、Bacillus。内生真菌对沉香结香的促进效果较明显，其作用机制为刺激植物产生树脂，提高木材密度，或使内生菌为植物提供前体物质。

沉香表皮和叶片受到植物病原菌的侵袭较为明显，其真菌群落主要由真菌病原菌构成，但目前这些真菌对提高白木香结香的作用机理尚不明确。本研究通过高通量测序的分析方法，揭示了白木香不同组织的内生菌群多样性和丰富度，以及其在宿主不同组织部位的差异，为白木香结香原理、内生菌群与宿主互作关系以及代谢活性产物的开发利用提供理论基础。

材料与方法

材料采集和处理

于2021年09月在广西钦州浦北县张*镇黄**大村(22.1 016 675°N、109.3 635 877°E；海拔76 m；年平均气温25±1 ℃)进行了沉香树样本采集。该树树龄约130年、树高15 m、胸径64.5 cm。在不过分伤害沉香树的前提下，采集根部(R)、叶片(L)、树干表皮有明显病斑部位(E)和表皮以下2~3 cm木质部组织(X) ，进行表面消毒后裁剪成为0.5 cm×0.2 cm小块，放入灭菌EP管中，编号记录，保存于-80 ℃。

16S和ITS rRNA群落分析

高通量测序

使用HiPure Stool DNA Kits试剂盒（美基，中国）提取菌群总DNA。选取16S rRNA(V3+V4)区以及ITS作为PCR扩增与测序的目的区域，引物为341F：5′-CCTACGGGNGGCWGCAG-3′和806R：5′-GGACTACHVGGGTATCTAAT-3′、ITS1_F_KYO2: 5′-TAGAGGAAGTAAAAGTCGTAA-3′和ITS86R: 5′-TTCAAAGATTCGATGATTCAC-3′。

用2%琼脂糖凝胶提取扩增产物，并使用AxyPrep DNA凝胶提取试剂盒进行纯化，使用ABI StepOnePlusReal-Time PCR系统进行定量。将纯化的扩增产物在Illumina平台上进行等量混合，连接测序接头，构建测序文库，Illumina PE250上机测序。

沉香内生菌测序结果分析

使用Usearch软件将得到的原始数据进行分析，先对低质量Reads进行过滤，然后将双端Reads拼接为Tag，再对Tag进行低质量过滤，得到的数据称为Clean Tag。接下来基于Clean Tag，使用Usearch软件进行聚类，去除聚类过程中检测到的嵌合体Tag，获得OTU的丰度和OTU代表序列，并使用Silva rRNA数据库（http://www.arb-silva.de）对OUT代表序列进行物种注释。

菌群Alpha、Beta多样性分析

为了评定样品内物种的丰富程度和多样性情况，使用Qiime(Version 1.9.1)软件对observed_species（Sob）、Chao1等4种α多样性指数进行计算。使用Muscle(Version3.8.31)进行序列比对，FastTree(Version2.1)构建聚类树，然后在R软件中绘制主坐标分析图。

结果与分析

沉香内生菌群测序结果质量分析

沉香不同组织样品稀释曲线表明，在真菌群落中，根部的物种丰富度最高，木质部最低；在细菌群落中，表皮的丰富度明显高于其他部位。随着测序量的增加，曲线趋于平缓并达到平台期，可以认为测序深度增加已经不影响物种多样性，说明测序量足够且合理，可以反映内生菌群落的真实情况。

由Rank-Abundance曲线可以看出，在真菌群落中，根部的真菌群落丰富度最高，其次是表皮与叶，木质部最低；但各个部位的曲线较为平缓，物种分布比较均匀。在细菌群落中沉香表皮的曲线相对木质部、根和叶的曲线相较平缓、物种分布较为均匀，但表皮的物种丰富度最高，且叶、根和木质部之间无明显差异。

沉香内生菌群落多样性分析

对沉香不同组织样品内生菌进行测序后，根据物种注释情况，进一步采用Sobs、Shannon、Simpson、Chao和ACE指数揭示沉香不同组织样品内生菌的α-多样性，其中Shannon和Simpson指数用来衡量物种多样性，Sobs、Chao指数和ACE指数代表物种的数量。

结果表明，沉香表皮内生真菌的Simpson指数和Shannon指数低于其他部位，Sobs、Chao1和ACE指数与其他部位相比均无明显差异；叶片内生真菌的Simpson指数和Shannon指数均高于其他部位根部与木质部的Simpson指数和Shannon指数无明显差异。

沉香表皮中内生细菌的ACE、Sobs、Chao1、Simpson指数和Shannon指数均显著高于其他部位，表明表皮中细菌群落丰富度以及物种多样性均高于其他部位、根部、木质部和叶片内生细菌的Sobs、Chao1和ACE指数无明显差异；叶与根部中内生细菌的Simpson和Shannon指数表明了其细菌多样性最低。

沉香内生菌群落组成分析

通过比较真菌ITS1基因的组成和结构，研究了沉香不同组织内生真菌群落的差异情况。选取真菌群落属水平的丰度前10物种，生成物种相对丰度图。在属水平上，根部内生真菌主要由Cladosporium(53.16%)组成；木质部中的优势菌为Penicillium(54.38%)；Lasiodiplodia为表皮的优势菌94.38%；而叶片中的优势菌为Purpureocillium(33.59%)。

不同部位的内生真菌丰度差异较大，叶中Phialemoniopsis、Trichothecium、Pyrenochaetopsis、Purpureocillium和Acremonium丰度高于其他部位；但木质部中Penicillium和Arthrinium相对其他部位也呈现了较高的丰度；Cladosporium仅在根部拥有了较高的丰度；表皮中Lasiodiplodia丰度略高于其他部位。

由此可见，沉香不同组织真菌群落组成及其相对丰度有着较大的差异，表皮中的真菌种类丰富度高于其他组织，且具有较好的均匀度，同时具有明显的偏好性，Lasiodiplodia表现出更高的优势性。

选取细菌群落属水平的丰度前10物种，生成物种相对丰度图，研究了不同部位沉香组织内生细菌群落的差异情况。在属水平上，沉香内生细菌物种组成相较真菌拥有更好的多样性。根部内生细菌主要由Cronobacter(24.67%)以及Pantoea(23.92%)组成；Rosenbergiella在木质部细菌群落占比较大(43.91%)；表皮中主要由Burkholderia-Caballeronia-Paraburkholderia(31.34%)组成；叶片中内生细菌主要为Pantoea(33.59%)。

通过细菌丰度热图分析，结果表明在表皮中Burkholderia、Streptomyces、Novosphingobium以及Allorhizobium这4个属丰度相较于其他部位较高；Pantoea在根部和叶片中的丰度相近且高于其他部位，同时根部中的Cronobacter、叶片中的Pseudomonas丰度也高于其他部位；Rosenbergiella在木质部中拥有了较高的丰度。沉香内生细菌在群落组成及其相对丰度也体现出了较大的差异，不同部位的优势菌差异较大，体现了菌群对组织部位的偏好性。

沉香内生菌群落的功能类群预测与分析

采用FUNGuild对沉香不同组织内生真菌群落进行功能预测分析，生态营养型及各营养型在不同样品中的丰度信息如，沉香不同组织*共中**有且相对丰度超过1%的功能类群为Endophyte-Plant Pathogen-Wood Saprotroph，在根部、木质部、叶片、表皮的占比分别3.37%、4.42%、3.63%和94.38%，同时该类群为表皮中的优势类群。

各个部位均分析出大量未鉴定的功能群，在根部占比最高为84.37%，其次是叶、木质部和表皮，分别为43.13%、18.83%和2.64%。忽略未鉴定功能群，根部相对丰度最高的类群为Undefined Saprotroph(9.60%)；木质部中Plant Pathogen和Plant Saprotroph分别占比54.98%和19.32%；表皮中的优势类群相似为Endophyte-Plant Pathogen-Wood Saprotroph；Fungal Parasite为叶片中相对丰度最高的功能群，占比33.59%。

对各样品进行详细的物种生态功能预测。沉香不同组织*共中**有且相对丰度超过1%的功能类群为Endophyte-Plant Pathogen-Wood Saprotroph。具有Endophyte-Plant Pathogen-Wood Saprotroph功能的Lasiodiplodia是表皮的优势菌属(94.38%)，木质部中的优势类群为Plant Pathogen和Plant Saprotroph，相对丰度为54.98%和19.32%。其余生态功能相对丰度在不同组织中占比均较低，其中包含具有可以促进植物生长发育、产水解酶和氧化酶、分解有机质、促进养分循环等作用的Wood saprotroph(木质腐生真菌)功能类群。

图 2 基于 FUNGuild 的功能分类单元预测

采用FAPROTAX对沉香不同组织内生细菌群落进行功能预测分析，生态营养型及各营养型在不同样品中的丰度信息如图3 。沉香不同组织中拥有大量未被鉴别的功能类群，忽略未鉴定功能类群，chemoheterotrophy为根、木质部、表皮和叶丰度最高的功能类群，分别为18.17%、7.98%、23.68%和25.61%。此外，表皮中甲烷途径丰度显著高于其他部位，如hydrogenotrophic_methanogenesis、methanogenesis_by_CO2_reduction_with_H2和methanogenesis。

图3 FAPROTAX对细菌群落功能分类群的预测

a：生态功能叠加图；b：功能预测聚类热图；R：根；X：木质部；E：表皮；L：叶片。

研究表明，内生菌与白木香在野外环境下形成共生，具有高度的菌群多样性，并且这种内生关系能够提高植物对环境压力的抗性。结果表明，沉香不同组织内生菌群落多样性、组成及相对丰度差异明显，具有组织特异性。内生菌在植物体内的分布受寄主组织的化学性质、湿度、温度、季节变化等环境因素的影响。

在本研究中，所有部位的内生细菌丰富度以及多样性均高于真菌。在真菌方面，沉香各个部位真菌丰富度差异不显著，根部体现出更佳的物种的丰富度；在细菌方面，表皮中细菌群落丰富度以及物种多样性均高于其他部位。大量研究表明根系与叶片中的内生菌丰度高于其他部位；与本研究的结论存在差异。

这可能与宿主的特性有关，白木香生长土层厚、腐殖质多的湿润且疏松的砖红壤或山地黄壤中，这种土壤环境在一定程度影响了根部内生菌结构。一项对马六甲沉香树和土壤中群落的研究表明，茎部真菌Shannon指数显著高于土壤。

对沉香不同组织内生群落组成和优势菌群的分析结果显示，根、木质部、叶和表皮中蕴含着丰富的内生菌群。在门水平下，细菌主要优势菌为Proteobacteria、Cyanobacteria、Firmicutes、Actinobacteria，人参(Panax ginseng)内生细菌以Proteobacteria、Bacteroidetes、Actinobacteria为主; Lycium ruthenicum Murr内生细菌进行了分析，表明其主要的优势菌门为Proteobacteria、Actinobacteria、Firmicutes。

在属水平上，沉香内生细菌主要以Cronobacter、Pantoea、Rosenbergiella和Burkholderia为主。沉香茎部中分离得到的细菌主要为Pantoea、Roseomonas、Bacillus、Stenotrophomonas和Streptomyces。有研究表明植物内生细菌最常见的有Bacillus、Burkholderia、Microbacterium、Micrococcus、Pantoea、Pseudomonas和Stenotrophomonas，其中Bacillus和Pseudomonas为优势属。Bacillus是一种真菌病原体，它可以抑制真菌的生长，例如Saccharicola、Cochliobolus、Alternaria 和 Fusarium。

本研究中，真菌的主要优势菌属为Cladosporium、Penicillium、和Lasiodiplodia，还包括Trichothecium、Purpureocillium、Phialemoniopsis等，但其中镰刀菌(Fusarium)、毛色二孢菌(Lasiodiplodia.)、可球二孢菌(Botryodiplodia theobromae)、曲霉(Aspergillus)、木霉(Trichoderma)、毛霉(Mucor)、青霉(Penicillium)等是重要的植物病原真菌[15,16,17,18]，但这些植物病原菌在不同组织中的组成和相对丰度差异较大。

叶片中优势菌属分布较为平均，可能是因为叶片中含有较高的蛋白质、多糖和维生素等活性成分物质，为不同内生真菌的生长提供了营养物质。本研究优势菌属与之前报道内生细菌组成结构大致相同，其中部分优势菌属的差异可能是由于样品生长年限较长、环境以及宿主不同导致。

通过真菌堆叠图表明Lasiodiplodia属在表皮占比达到94.38%，这与先前研究表明的Trichoderma属为优势菌属不同，Trichoderma可以有效地诱导沉香木的形成(Chhipa and Kaushik, 2017)。但也有研究表明在沉香中观察到Fuasrium和Lasiodiplodia是受侵染沉香中的主要菌属，同时Trichoderma属在受侵染样品中的分离频率较低，提出在沉香结香过程中，Trichoderma属在树脂形成中的作用很小或没有作用，或者可能在不同的时间起作用，同时提出Fuasrium菌属和Lasiodiplodia属是沉香结香的主要诱因。

本研究所采取样品同是受侵染沉香样品，其表皮中的优势菌属为Lasiodiplodia属，达到94.38%，进一步支持了该可能性。有研究使用从沉香中分离出的 Fuasrium和Lasiodilodia 感染白木香，发现这两个属都有效地诱导了沉香木的形成，但Lasiodilodia 表现出更好的稳定性。

FUNGuild功能预测结果显示，沉香各个组织*共中**有且相对丰度超过1%的功能类群为Endophyte-Plant Pathogen-Wood Saprotroph。而FAPROTAX功能类群预测结果中，chemoheterotrophy是根、木质部、表皮和叶丰度最高的功能类群。结果表明，真菌群落的营养类型更加复杂，在功能上采用多种营养方式兼容，提高了代谢更能的多样性，用来应对生存环境的改变。

在本研究中，表皮优势真菌Lasiodiplodia是Endophyte-Plant Pathogen-Wood Saprotroph营养型相互交叉的菌群。Lasiodiplodia是表皮中的优势属(94.38%)，有大量文献表明Lasiodiplodia对植物具有显著的致病性。木质部中的优势类群为Plant Pathogen和Plant Saprotroph，相对丰度为54.98%和19.32%，其优势菌属为Penicillium(54.38%)。据报道Penicillium具有Plant Pathogen和Plant Saprotroph的生态功能，会导致植物绿霉病。

根部以Undefined Saprotroph(9.60%)为主，此类群主要负责养分循环和植物-土壤相互作用，有利于植物更好地吸收土壤养分以及对腐烂养分的降解。叶片中的优势菌属Purpureocillium为Fungal Parasite的功能做出了贡献。

其它真菌菌群功能研究表明，各个组织部位中含有多种相对丰度 ≥ 1%的条件致病菌，但各个部位致病菌差异显著，这可能与致病菌存在一定的组织偏好性有关。各个组织部位中相对丰度≥1%的腐生种类较多，由于土壤中腐生真菌和细菌的种类十分丰富，而根与土壤密切接触，在长期的相互作用过程中，腐生菌更有选择性地进入根内成为内菌，并扩散到植物的地上部分，如花、叶和果实。

但FunGuild是基于已有的文献报道对真菌功能进行预测，基因信息相对较少，而FAPROTAX也存在大量无法鉴定的功能。由于内生菌的生物学功能较复杂，真菌与细菌在宿主中互作机制尚不完善，无法将分类信息注释到功能基因以及代谢途径上去，其准确性还需进一步提高。

此外，高通量测序还发现，沉香中存在大量未鉴定到种属的内生菌，虽然相对丰度较低，但其中可能存在一些新种和中间代谢产物有待深入发掘。还需要采用微生物培养组学技术，根据高通量测序结果，对特定菌种设计相应培养基，这对一些相对丰度较低、未鉴定出种属的内生菌进行分离纯化和次生代谢产物研究具有十分重要的意义。

《蔗及甘蔗近缘属内生菌的筛选、鉴定与功能研究》

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《人参内生菌种类、化学成分及生物活性研究进展》

《苹果砧木T337不同组织内生菌群落及其功能预测》