前言：
酶联免疫吸附测定法是一种基于抗原-抗体反应原理的生物化学分析技术 ，通过添加底物，测定酶催化反应产生的信号物质的含量，从而间接或直接定量分析目标分析物的浓度。
我们研究发现，使用酶联免疫吸附测定法对无控制燃烧引起的二恶英土壤污染进行筛查，能够有效检测出土壤中的二恶英污染物，并提供了可靠的定量信息。
化学药品
玻璃蒸馏级的溶剂（*酮丙**、甲苯、正己烷、二氯甲烷和甲醇）用于提取和净化，将8克NaCl、0.2克KH2PO4、2克Na2HPO4·7H2O、0.2克KCl溶解在每升去离子水中，添加0.05%Tween20（PBST），制备pH为7.5的磷酸盐缓冲盐水（PBS）溶液。
涂膜缓冲液的配方为1.6克Na2CO3和2.9克NaHCO3溶解在每升去离子水中，pH为9.6，底物溶液由400微升0.6%的3，3'-四甲基联苯胺溶解在DMSO中，以及100微升1%的H2O2溶解在25毫升pH为5.5的100毫摩尔柠檬酸/乙酸缓冲液中。
样品
从8个不同的贫民窟收集了16个样品，这些样品显示了可见的小规模燃烧的迹象，在所有情况下，采样点都位于燃烧痕迹附近（距离为1-2米）。
样品采集时使用了干净的不锈钢勺子，采集的深度为0-5厘米，确保只采集到表层的样品，采样点周围的岩石、植被和碎片都被清除掉了。
每个样品在100°C下进行过夜的干燥，被粉碎并通过2mm筛网筛选，以确保样品的充分均质，在提取之前，每个样品都被称重。
样品制备
对土壤样品进行甲苯提取处理， 持续时间为15小时 ，提取物随后被分割，并添加同位素标记的内标物质，以校正GC-HRMS分析过程中的分析物损失。
提取物进行并行纯化处理之，使用连续的柱进行清洁过程，将提取物应用于多层硅胶柱，其中包括35%的氢氧化钾-二氧化硅（w/w）， 活性二氧化硅 ，40%的硫酸-二氧化硅（w/w）和Na2SO4位于顶部，并使用正己烷进行洗脱。
使用含有AX-21/硅藻土（1：12，w/w）的碳柱进行进一步的净化，干扰化合物通过二氯甲烷/正己烷（1：1，v/v）进行洗脱，将碳柱倒置，并使用甲苯洗脱目标分析物。
采用小型多层硅胶柱，并用正己烷进行洗脱，在进行GC-HRMS分析之前，将加有内标物质的纯化提取物的溶剂更换为十四烷。
未加标的纯化提取物的溶剂更换为 二甲基*砜亚**（DMSO） ，并将所得样品分为两部分进行ELISA分析。
主成分分析
软件SIMCA-P+™版本11使用主成分分析（PCA）来评估样品之间在同基因谱方面的关系，在进行PCA之前，对每个样品中非邻位多氯联苯和/或PCDD/PCDF同源物的相对丰度数据进行了对数变换，按单位方差缩放，并以平均值为中心，计算出了两个主成分。
酶联免疫吸附分析
在4℃下，将高结合微量滴度板中的每个孔包被100μl的III-BSA包被抗原（包被缓冲液浓度为0.05μg/ml）过夜。
在PBST洗涤后， 加入200μl的阻断液 （0.5%BSA在PBS中），并在室温下孵育30分钟。之后进行3次PBST洗涤。
在含有0.2%BSA的PBS中将稀释1/3500的7598抗体加入每个孔中，每孔加入50μl，同时加入每孔50μl的样品或标准品（TMDD在含有0.01%TritonX-100的PBS和DMSO的1:1的溶液中配制）。
将培养皿孵育90分钟，进行5次PBST洗涤，加入稀释1:3000的山羊抗兔免疫球蛋白G与辣根过氧化物酶偶联（每孔100μl的PBST），在室温下孵育60分钟。
再次进行5次PBST洗涤后，加入底物溶液（每孔100μl），使用2M硫酸（每孔50μl）浸泡10-20分钟，停止显色，测量450和650nm两个波长的吸光度。
通过绘制吸光度（A450-A650）与TMDD浓度的对数关系，得到标准曲线，并使用四参数logistic方程进行拟合。
其中y={(a−D)/[1+(x/C)B]}+D，a表示无分析物时的最大吸光度，B表示曲线斜率在拐点处的值，C表示分析物浓度为50%抑制时的值，D表示无限浓度时的最小吸光度。
在免疫测定中，使用替代标准物TMDD，采用酶联免疫吸附法（ELISA）对土壤样品进行TMDD标准曲线分析，并使用TMDD交叉反应因子（130%）表示TCDD当量。
所有样品提取液和标准品进行三次分析，准确性评估基于加标提取液的加标回收率以及板内和板间重复分析的相对标准偏差百分比（%RSD），使用至少三种不同的稀释度分析样品提取物。
结果和讨论
由于GC-HRMS分析的成本较高，我们只能对16个样品进行分析，含有大量的多氯二苯并对二噁英/多氯二苯并呋喃，并通过GC-HRMS进行确定。
其中三个样品（占总样品数量的19%）的住宅土壤中二恶英的浓度超过了指导水平1，000pgTEQ/g，通过GC-HRMS分析，这三个样品的实际浓度 分别为1，005、1，070和1，790pg/g 。
有毒物质和疾病登记处针对住宅土壤中PCDD/PCDFs的污染制定了三个不同的指导级别：筛查水平（TEQ值≤50pgTEQ/g）、评估水平（TEQ值在51至999pgTEQ/g之间）和行动水平（TEQ值≥1，000pgTEQ/g）。
可以使用ELISA作为一种低成本的筛选技术 ，来鉴定燃烧点中超过1，000pgTEQ/g的含量水平。
酶联免疫吸附法/指导性色谱仪-人力资源管理系统验证
本研究采用的ELISA已经证明与沉积物、土壤和生物基质中使用GC-HRMS测定的毒性当量(TEQ)相关。
这种相关性取决于样品中同源物的分布，并且需要使用ELISA校正因子来估计样品间主要变化的毒性当量，从而限制了ELISA技术的实用性，特别是在未受控制的杂项废料燃烧情况下，这一点尤为重要。
我们最初使用GC-HRMS结果来研究样品面板中多氯联苯(PCB)/多溴联苯(PBB)成分的固有变异性，为了获取每种同源物的相对丰度，将其浓度除以分析的17种同源物的总浓度。
在毒性方面，四氯和五氯的二恶英与样品最相关，而氯化程度较高的化合物则不太重要，为了揭示它们之间的差异和分组情况， 采用了主成分分析(PCA) 。
主成分分析被用于研究多氯二苯并对二恶英/多氯二苯并呋喃和多氯二苯并对二噁英/多氯二苯并呋喃的同族元素，包括非邻位多氯联苯。
每种同源物的相对丰度是通过将其浓度除以所量化的目标同源物的总浓度来获得的，第一个主成分（PC1）与这些相对丰度相关，前两个主成分（PC1和PC2）解释了总方差的79%，包括存在和不存在非正交多氯联苯的情况。
主成分1主要捕捉了多氯二苯并对二噁英/多氯二苯并呋喃的总体差异，解释了总方差的略多于一半，或者当同时考虑多氯二苯并对二噁英/多氯二苯并呋喃和非邻位多氯联苯时，约占总方差的三分之二。
即使土壤样品来自不同的不受控制的燃烧点，观察到的同源物组成不太可能导致不同的ELISA反应。
这是因为PCB77具有非常低的交叉反应性，并且八氯-二苯并-二恶英与所使用的抗体根本不发生交叉反应，可以预期免疫化学方法可作为对研究中涉及不受 控制燃烧点进行二恶英评估的筛选工具 。
用酶联免疫吸附法筛选多氯二苯并对二噁英/多氯二苯并呋喃的临界值的定义
为了确定ELISA是否可以作为一种低成本的筛选技术来识别燃烧点中超过1，000pgTEQ/g的作用水平，我们需要定义一个阈值ELISA值。
根据目前的结果，我们决定提出ELISA的初步临界水平，该水平将用作更大规模筛选阶段的起点，只对超过临界值的样品进行GC/HRMS分析。
我们发现，通过将ELISA截止值设置为每克土壤100pgTCDD， 可以识别所有TEQ超过1，000pg/g的土壤样品 ，以及两个低于1，000pgTEQ/g的土壤样品（假阳性）。
事实上，同样的ELISA截止值也可以用于检测250pgTEQ/g的土壤，假阴性和假阳性的情况均为零。
为了进一步推进本研究并完善ELISA的阈值，有几个任务要完成，为了降低成本，只有ELISA值高于每克土壤100pgTCDD的样品才会进行 GC-HRMS测试 。
如果许多土壤样品的浓度介于100至120pgTCDD/g之间，在GC-HRMS测试中显示为高水平的二恶英阳性，那将意味着将阈值设得太高，将不得不重新定义我们的临界值。
假设没有发生这种情况，将了解GC-HRMS和ELISA之间的关系，逐渐接近我们感兴趣的阈值。
我们将根据经验而非基于模型的证据，权衡假阳性和假阴性之间的需求，以确定ELISA结果何时可以与GC-HRMS结果相对应。
根据实验数据显示，多 氯二苯并对二噁英/多氯二苯并呋喃的样本比例（19%）超过了住宅土壤标准 。
这证实了在不受控制的燃烧贫民窟土壤中进行更大规模的监测计划的必要性，以确定关键区域并进行适当的风险评估。
考虑到仪器分析的高成本，本研究中的样本数量有限，无法准确确定假阳性和假阴性的比率，通过使用每克土壤100pgTCDD当量的ELISA截止水平，能够检测到TEQ当量超过250pg/g的所有样品，这远低于住宅土壤的指导水平。
结论
尽管样品具有固有的复杂性，但本研究中使用的酶联免疫吸附试验已显示出其用于筛选目的的前景。
研究结果表明，酶联免疫吸附测定法是一种快速、准确且经济的工具，可用于监测和评估无控制燃烧引起的二恶英土壤污染情况。
该方法的应用有助于及早发现并采取相应的环境保护措施，以 减少二恶英对环境和人类健康的潜在风险 。
参考文献：
【1】韦恩，《多氯联苯的毒性当量因子，多氯二苯并对二噁英、多氯二苯并呋喃用于人类和野生动物》
【2】舍特斯，《多氯联苯和二恶英对儿童健康的影响》
【3】科尔，《二恶英和癌症：批判性审查》
【4】卡马乔，《摄入被多氯二苯并对二噁英和多氯二苯并呋喃污染的橄榄油引起的氯*疮痤**》