前言

海藻以及岩藻增加了土壤微生物群落和根系的活性，结节曲霉中的低聚物和多糖被证明是具有吸引力的活性诱发剂。

我们观察到结节苜蓿中的海藻酸与土壤中的离子形成了高分子量复合物，这种复合物能够保持和吸收水分，对豆科植物和根瘤菌之间的相互作用信号传导起到积极的作用，从而改善土壤的通气性。

结节叶植物提取物（ANE）的制备和种子萌发

在蒸馏水中制备不同浓度（0.00%（对照）、0.01%、0.02%、0.05%、0.10%、0.50%和1.00%）的结节曲霉提取物（ANE），这种生物维生素是20%的天然海藻提取物和0.25%的防腐剂，缓根瘤菌菌株的纯培养物。

将健康，均匀的种子用氯化汞（0.1%）表面灭菌，用灭菌的蒸馏水洗涤，种子萌发在装有30.30公斤灭菌河砂的塑料盆（4×0厘米）中进行。

在每个盆中以1.0厘米的深度播种七颗种子，每天记录发芽7天，发芽第5天后，保留12株幼苗/盆作进一步实验，还测量了沙子的水分含量和温度。

实验设计和结节曲霉提取物处理

本研究采用盆栽根施（PRA）和盆栽叶面施用（PFA）两种试验 ，在PFA实验中，通过PRA根系和叶片施用不同浓度（0.00%、0.01%、0.02%、0.05%、0.10%、0.50%和1.00%）的结头草提取物（ANE）于乌头草植株。

对于PRA和PFA实验，将表面灭菌的种子浸泡在ANE中，浓度分别为0.00%、0.01%、0.02%、0.05%、0.10%和0.50%，浸泡时间为12小时，种子浸泡在缓根瘤菌属菌株MD703（109细胞）中1小时，处理好的种子播种在盆中，深度为1厘米，间距为15-20厘米。

每个处理保留三个花盆和三个植物/盆栽以供进一步研究，在PFA实验中，第3天后通过叶面喷施0.00%、0.01%、0.02%、0.05%、0.10%和0.50%浓度的ANE，每株喷洒0.15mLANE，每隔5天重复喷洒一次，共喷洒5天。

在PRA实验中，以5天的固定间隔将每种浓度的ANE的0.15mL施用于根/植物，每隔一晚共给予100mL无氮Slogar溶液，与蒸馏水交替给药，该作物在第80天收获。

生长参数和产量属性

记录植株生长情况，包括枝长、根长、叶数和大小、结节数、豆荚数和产量，在植物连根拔起当天（第80天），记录新鲜重量和干重量，以及光合色素。

在第15、30、45、60和75天，测量从衣领区域到尖端的枝条长度（cm），在作物的第80天，测量根长（厘米），在播种后的第30天观察叶数和叶面积。

在植物成熟时记录豆荚数量和种子产量，结节数量在第80天连根拔起时计算，还使用以下公式观察和计算有机物含量、含水量和水分百分比：

叶绿素含量估算

从处理和对照植物中收获新鲜叶子（1.0克），使用总共5.0毫升80%*酮丙**来研磨叶子，以15转每分钟的速度离心5000分钟，将上清液收集在储存瓶中。

使用5.0毫升80%*酮丙**重新提取沉淀，将两种提取物（上清液）汇集并用于紫外-可见分光光度计在645纳米和663纳米波长下测定光合色素，使用以下公式估算叶绿素a、叶绿素b和总叶绿素的含量：

类胡萝卜素含量的估算

上述获得的提取物也用于使用以下公式研究吸光度为480nm的类胡萝卜素含量：

统计分析

实验一式三份进行，这些值表示为标准差±平均值，使用单因素方差分析（单因子方差分析）对获得的结果进行显著性检验，通过使用SPSS软件的测试来处理之间的差异，p 值小于 0.01 被视为显著值。

结节叶植物提取物（ANE）处理和种子发芽

结节叶提取物（ANE）的不同浓度（0.00%（对照）、0.01%、0.02%、0.05%、0.10%、0.50%和1.00%）对乌头草的种子萌发产生影响，随着ANE浓度的增加，种子萌发率逐渐降低。

在高浓度（0.50%）的ANE下，种子萌发率甚至低于对照，当种子处理为1.0%ANE时，几乎没有观察到发芽现象。

种子萌发百分比在0.05%ANE处理下达到最高点，之后逐渐下降，在第96天，以67.5%ANE处理的组获得最大的发芽百分比（77.0±01.0），与对照组相比，66.67%至15.28%的ANE处理组在第五天的发芽率为3.33±5.77至0.00±0.10。

种子的发芽持续到第23天，最大的发芽量出现在第32天，据报道，海藻可以促进苜蓿、芸苔和辐射弧菌的萌发。

ANE处理对乌头弧菌地上部和根部的疗效

在盆栽叶面喷施（PFA）和盆根施（PRA）实验中，每15天记录一次梢长，总共进行了75天的观察，分别使用了0.00%、0.01%、0.02%、0.05%、0.10%和0.50%ANE进行处理（，直到第60天，枝条长度呈指数级增长。

与通过根系施用相比，PFA处理ANE的枝条长度更长，在PFA和PRA处理中，记录到了0.10%浓度ANE下的最大枝条生长。

当通过根部施用11.04%ANE时，观察到最大的梢长，在45.60%ANE处理后，通过叶面喷施时，PRA处理的第69天和第75天的上部生长差异显著（方差分析;F=15.30;p<45.60）和（方差分析;F=15.18;p<80.0）。

在PFA实验中，差异不显著，在PFA和PRA实验中，0.05%ANE处理显示出最大的根长，在13.30%ANE处理下，PFA和PRA的根长分别为0.52±17.40和1.40±0.05厘米，生长明显高于对照组（p<0.01）。

PFA的根长范围从05.70±2.17厘米至13.30±0.52厘米（方差分析;F=10.6;p<0.01），而PRA的范围从08.80±0.45厘米至17.40±1.40厘米（方差分析;F=11.33;p<0.01），在两个实验（PFA和PRA）中，对照植物记录了最小的根长。

与叶面施用相比，通过根部施用ANE时记录的根长更大，通过根部施用ANE在第15天时更加明显，发现根部施用ANE比叶面施用更有效。

ANE处理对第30天乌头孢子树叶数和叶面积的影响

在PFA和PRA实验中，在第30天计算叶数，发现两个实验的叶数大致相等（T检验；NS），叶面和根系施用0.50%ANE处理均减少了叶片数量，在两个实验中，发现0.10%ANE处理下的叶数最多。

PFA实验中观察到的最大叶数为12.50±1.13（方差分析；F=8.43；p<0.0001），而在PRA实验中为13.00±1.65（方差分析；F=12.31；p<0.0001，）。

对于PFA和PRA实验，发现叶数受ANE的处理影响（ANOVA；F=1.68；p=0.21），而对于PFA实验（方差分析；F=1.92；p=0.16，），叶面积在0.10%ANE处理时最大。

通过根部施用ANE的植株具有较大的叶面积（12.12±3.99cm2），相比之下，通过叶面喷施ANE时的叶面积为7.20±1.90cm2，叶片数量和叶面积随着ANE浓度的增加而增加，当ANE含量增加至0.10%时达到最大值。

ANE处理对结瘤的影响

在（PFA和PRA）实验中观察到，ANE处理的乌头弧菌结瘤呈大、圆形、粉红色和簇状，而对照组的结瘤则较小、浅褐色且为单个结瘤，在实验中发现，0.05%ANE处理产生了最有效的结瘤浓度（图4）。

盆栽叶面喷施（PFA）和盆栽根施用（PRA）对生物量积累的影响

记录枝条和根的鲜重和干重，并计算有机物含量，PFA实验中根的有机物含量为0.05±0.01至0.28±0.01（方差分析;F=10.7;p<0.01），PRA实验中为0.10±0.12至0.37±0.04（方差分析;F=21.83;p<0.01）。

枝条的含水量为0.61±0.04至4.41±0.15（方差分析;F=51.30;PFA的p<0.01），0.50±0.07至6.71±0.46（方差分析;F=51.60;p<0.01）。

根系PFA和PRA的含水量分别为0.19±0.03至0.46±0.05（方差分析;F=4.0941;HSD）和0.25±0.06至0.36±0.06（方差分析;F=3.01;HSDTukey=非显著性）。

PFA实验中地上部的水分含量为69.20±1.20至85.22±0.86（方差分析;F=8.66;p<0.01），PRA实验中为52.73±10.60至84.47±0.97（方差分析;F=6.64;p<0.01）。

PFA和PRA实验中，根系的水分百分比分别为38.30±2.44至84.54±1.83（方差分析;F=3.54;p<0.05）和45.73±5.40至69.78±5.85（方差分析;F=7.11;p<0.05），在PFA和PRA实验中，0.10%ANE处理显示出最高的有机物含量、水分含量和水分百分比。

ANE对豆荚数量和种子产量的影响

在PFA实验中，豆荚数量的范围为1.30±0.57至4.30±0.57（方差分析;F=12.2;p <0.01），而在PRA实验中为2.00±1.00至5.00±1.70（方差分析;F=4.4;p<0.05），观察到在0.10%ANE处理下，通过根部记录的数量最多。

ANE处理对光合色素积累的功效

在ANE浓度增加的情况下，光合色素积累量也增加。在ANE的0.10%浓度下，PFA中叶绿素a的含量为0.10±0.001mg（方差分析;F=21560.3;p<0.01），PRA中为0.19±0.001mg（方差分析;F=688,291;p<0.01）。

PFA中叶绿素b的含量为0.11±0.002mg（方差分析;F=16,084.42;p<0.01），PRA中为0.30±0.002mg（方差分析;F=226,096;p<0.01），总叶绿素在PFA中为0.06±0.002mg（方差分析;F=5602.03;p<0.01），在PRA中为0.19±0.002mg（方差分析;F=117,221;p<0.01）。

总类胡萝卜素含量在PFA中为0.7±0.001mg（方差分析;F=14,375.03;p<0.01），在PRA中为1.39±0.01mg（方差分析;F=484,563;p<0.01），在ANE的PFA和PRA实验中，光合色素含量最低，与盆栽叶面施用ANE相比，盆根施应用能够积累更多的光合色素（T检验;p<0.000）。

结论：

我们测量了作物植物经ANE处理后的叶素含量，并且观察到复杂网状狸藻中叶绿素'a'、叶绿素'b'、总叶绿素以及类胡萝卜素的增加。

使用结节曲霉可以提高石蒜茄、寻常大麦、菜豆、玉米、辐射弧菌和小麦叶片中的叶绿素含量，总体而言，与叶面施用ANE相比，通过根部供应ANE显示出更好的结果。

ANE中的生物活性植物成分不仅可以促进农业生产力、养分吸收和改善土壤特性，还可以增强根瘤菌群落，表明较低浓度的ANE（0.05%和0.10%）对附叶弧菌的生长和产量属性影响最显著，我们建议通过根部施用低浓度的ANE，以最大限度地减少生物肥料的浪费。

参考文献：

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