文|农农
编辑|农农
由于水稻的糖特性，水稻在苗期和繁殖期对盐度高度敏感，土壤中过量的盐通过产生渗透胁迫对水稻的生长发育产生不利影响。
水稻植株中Na+离子积累的增加破坏了各种代谢过程以及主要的形态生理和产量相关性状。
水稻种质资源中潜在的自然变异是改良理想性状的关键资源，都以在盐胁迫条件下生存的潜力而闻名。其中一些被用作培育耐盐品种的供体。
本研究对145个水稻基因型在盐胁迫下的不同形态生理性状进行了评价，以鉴定出新的耐盐基因型。
实验过程及方法
1、实验材料
本研究在印度卡纳尔ICAR-CSSRI对145个苗期耐盐性基因型进行了评价。
其中100个基因型来自不同地理区域的地方品种，其余45个基因型来自CSSRI、印度国立农业大学和其他ICAR研究所的高级选育品系。
我们使用pokkali衍生系FL478作为耐盐性检查，IR29作为盐敏感检查。
2、水稻苗期耐盐基因型筛选与验证
研究设置为对照和在温室条件下使用RCBD(随机完全区组设计)，进行2个重复的生理盐水环境试验。
水稻材料首先在没有胁迫的情况下使用吉田营养液水培12 d，每隔4 d将营养液更换为新鲜营养液。
在正常环境下，12 d后将建立的幼苗转移到相应的胁迫条件，在pH为4.5 ~ 5.5的条件下，向营养液中加入一定量的NaCl，建立胁迫条件。
每个基因型各保留25株幼苗，在盐处理后约14 d, IR29死亡时收集数据。
3、形态生理性状评估
通过肉眼观察，如胚芽颜色、种皮颜色(籽粒颜色)、外稃颜色和古皮颜色等，研究了不同基因型的形态多样性。
观察了各基因型完全成熟种子的种皮、外稃和外稃的颜色。在对照水培试验第10天的幼苗上记录了所有基因型的胚囊颜色。
记录了植株活力、根长、茎长、Na+、K+、Ca2+、Mg2+含量和枝条Na+ /K+比值等8个盐响应性状。
在盐渍化后14 d，取胁迫和对照环境下各复制的不同参数数据，采用水稻标准评价系统(SES)对盐害成活率和受影响总叶面积评分进行评估。
4、DNA提取、PCR扩增、凝胶电泳
采用改良的CTAB法从14日龄幼苗的新鲜叶组织中进行DNA分离，使用紫外-可见分光光度计将所有样品的DNA浓度调整为20-25 ng/L。
PCR反应在Biometra T梯度热循环仪上进行，10 μL体积含有50 ng模板DNA，每个引物0.5 μL, Taq-&LOADTM PCR母料。
热循环器程序设置为95ºC初始变性5分钟，然后是35次变性，退火和延伸，最后72ºC延伸1次，延伸7分钟。
随着DNA阶梯，PCR扩增产物在溴化乙啶染色琼脂糖凝胶上可视化，并使用凝胶记录系统进行记录。
5、统计分析
对不同性状的形态和生理数据进行均值、标准差和变异系数等描述性统计。
此外，采用STAR 2.1.0软件对正常、应力和相对应力三种情况进行组合方差分析。
各基因型的SSI计算公式为: SSI = (1 - Ys / Yp) / (1 - Xs / Xp)，其中Ys为单个基因型在胁迫下的观察表型值。
Yp为单个基因型在非胁迫下的表型值，Xs为所有基因型在胁迫下的平均表型值，Xp为所有基因型在非胁迫下的平均表型值。
实验结果
1、基因型在生理盐水和对照条件下的表现
在正常环境和应激环境下对145个基因型进行了两种检测。
通过计算各性状的胁迫敏感性指数确定各基因型相对于正常条件下的胁迫反应，并将其视为相对胁迫。
方差分析结果表明，基因型和基因型×环境的差异均极显著(P < 0.01)。
除茎部Mg2+含量外，其余性状在正常、胁迫和相对胁迫条件下的差异均极显著。
研究性状的显著平均平方和表明基因型之间存在差异，以及每个基因型在处理过程中的差异反应。
2、相关分析、主成分分析和聚类分析
利用正常、胁迫和相对胁迫3个条件下的所有性状数据进行相关系数估算、主成分分析和基因型聚类分析。
为了更好地理解形态生理性状之间的关系，我们估算了各性状之间的Pearson相关系数。
综合相关分析表明，各环境的相关系数分别为0.87、0.21和0.17。
茎部Na+含量与SES评分和Na+ /K+比值呈正相关。
SES核心与Na+ /K+比值的相关系数为0.83，茎部K+和Ca2+含量与SES评分呈负相关。
Na+ /K+比值与SES评分、茎部Na+含量呈显著正相关，与K+、Ca2+含量呈显著负相关。
同样，茎部Ca2+含量与茎部和根长呈负相关，与茎部Mg2+含量呈正相关，在盐胁迫条件下，幼苗活力与其他性状显著相关。
与Na+、K+、Ca2+、Mg2+含量及Na+ /K+比值呈正相关，与茎长、根长呈负相关。
在盐胁迫条件下，Na+ /K+比值与茎长和茎部K+含量呈负相关。
在相对胁迫条件下，活力评分与根长和茎长呈正相关，与茎部K+含量呈负相关。
我们发现Na+ /K+比值与茎部Na+和K+含量呈正相关，与茎部Ca2+和Mg2+含量呈负相关。
3、Saltol QTL区单倍型分析
利用11个与Saltol QTL连锁的多态SSR标记(位于10.4 ~ 15.4 Mb之间)进行单倍型分析。
17个耐受性基因型和2次检查的单倍型结果以图形形式呈现。
我们在每个SSR标记上发现最多4个等位基因，最少2个等位基因，用于单倍型分析的19种基因型共产生了19种不同的单倍型。
结果表明，Saltol位点存在多种等位基因，在新鉴定的17个耐药基因型中未发现与FL478相似的单倍型。
10个基因型(58.82%)在标记位点RM10694上与FL478相同。
我们记录到最多16个基因型(94.21%)，最少一个基因型(5.88%)在RM10800和AP3206F位点上显示出与IR29相似的等位基因。
此外，在AP3206F位点上，约有16个(94.12%)耐受性基因型存在FL478和IR29以外的等位基因，其次是RM10793和RM3412b(4个基因型)。
基因型et -18461在11个标记中最多有7个(63.64%)与耐受性型FL478相似，在MSM2基因型中，有72.73%(8个标记)的Saltol区域含有易感型位点。
在Saltol地区，除了FL478和IR29等位基因外，Suhasa和Tulasimog等位基因极少见(36.36%)。
耐盐基因型kuttimmanja、IET-13713I和Tulasimog与FL478相似的位点分别为36.36%、20.00%和18.18%，而与FL478和IR29不相似的位点分别为18.18%、20.00%和36.36%。
4、新鉴定水稻基因型苗期耐盐性的验证
对照和胁迫条件下基因型间SES评分、茎长和根长、Na+和K+含量以及Na+ /K+比值的方差分析均显著。
胁迫条件下，除茎部Na+含量的基因型×年互作外，其余互作分量均不显著。
在正常和逆境条件下，所有性状的基因型×年×位置互作分量均不显著。
实验结果讨论
方差分析表明，基因型与环境存在交互作用，基因型与环境之间存在交互作用。
先前的研究已经指出，基因型在压力和非压力环境下的行为不同。
通过对胚芽颜色、种皮颜色(籽粒颜色)、外稃和古外稃颜色等形态性状的目视观察，可以清楚地看出苗期耐盐性筛选采用了不同的基因型。
正常条件下基因型生长旺盛，芽、根健康，然而，在盐胁迫条件下，基因型表现出不同的反应，这可能是由于它们固有的耐盐能力。
在Saltol地区，库提曼雅、IET-13713I和图拉西莫格3个品系具有不同等位基因的苗期耐盐性。
所有这些品系的果皮颜色都与Cheriviruppu等已知的耐受性地方品种相似。
在这里，我们有效地使用相关、PCA和聚类分析工具将基因型分为耐受性和易感组。
参考文献
标记RM10793在3个耐受性株系中均发现了新的等位基因。新鉴定的耐盐品系可成为苗期耐盐品系的良好来源。
这些品系可用于培育新品种，以扩大遗传基础，并鉴定水稻耐盐性的新qtl。
参考文献
[1]Akbar M, Yabuno T, Nakao S。水稻耐盐品种选育:1 .某些水稻品种的耐盐性变异。昆虫学报，22(5):277-284。
[2]Bonilla P, Dvorak J, MacKill D, Deal K, Gregorio G，2002。利用重组自交系定位水稻1号染色体耐盐基因的RFLP和SSLP。中国农业科学, 85: 68–76。
[3]Cha-um S, Chuencharoen S, Ashraf M, Kirdmanee C。2012。多变量聚类分析筛选甘蔗耐盐基因型。植物细胞与器官，110(1):23-33。
[4]De Leon T B, Linscombe S, Gregorio G, Subudhi P K。2015。美国南部水稻幼苗耐盐基因型的遗传变异。植物科学，6:374。
[5]Dionisio-Sese M L, Tobita S。2000。盐度对不同耐盐性水稻幼苗钠含量及光合反应的影响植物生理学报，157(1): 54–58。
S。2000。盐度对不同耐盐性水稻幼苗钠含量及光合反应的影响植物生理学报，157(1): 54–58。