作者：何咏怡，古汶玉，汤敏儿，邓常继，钟国才，陈威*
关键词：呕吐毒素；胶体金；性能评价
摘要：胶体金快速检测越来越广泛应用于食品中真菌毒素的现场检测，研究从检测灵敏度特异性、重复性及参比方法一致性方面对呕吐毒素胶体金快速检测产品的性能进行系统性评价，旨在为呕吐毒素胶体金快速检测试剂盒的选取和质量评价提供技术参考。结果表明，该胶体金快速检测试剂盒符合检测小麦和玉米中呕吐毒素含量的技术要求，适合大批量样品的现场快速筛查。
脱氧雪腐镰刀菌烯醇(Deoxynivalenol)又称为呕吐毒素(Vomitoxin)，是典型的B型单端孢霉烯族毒素,摄人其高污染食物会引起急性胃肠道症状，如腹泻、拒食和呕吐，长期接触呕吐毒素还可导致厌食症、生长迟缓和免疫功能受抑制等。 呕吐毒素是谷物及其制品最易感染的天然真菌毒素之一，在小麦、玉米、大麦、黑麦和燕麦等谷物中均有检出，如2018年一项涵盖全球77个国家共13 629个样本的调查显示亚洲地区样品的呕吐毒素污染率达到80%。因此，监测食品和饲料中的呕吐毒素含量，对保障消费者健康及减少经济损失具有重要意义。
目前呕吐毒素常用检测方法包括：液相色谱—串联质谱法、气相色谱—质谱法、液相色谱法、酶联免疫吸附筛查法和胶体金快速检测等。其中胶体金快速检测是一种将胶体金颗粒作为示踪物，兼备免疫分析与色谱层析分离优点的检测技术，具有制备成本低、操作简单结果肉眼可判断及无需额外专业人员和仪器设备等优点，近年来广泛应用于检测食品中的呕吐毒素。
GB 2761—2017《食品安全国家标准食品中真菌毒素限量》中规定食品中呕吐毒素限量为1000μg/kg,《粮食质量安全监管办法》明确规定真菌毒素是粮食收购和储存的质量安全指标之一。但由于我国是产粮大国，2020年我国全年小麦和玉米产量分别达到13425万t和26067万t，在具体实施的过程中，检验人员检测任务重时间紧，因此选择合适的粮食呕吐毒素现场快速筛查手段对于提高粮食安全监督和收购效率具有实际意义。据此，本文从灵敏度、特异性、重复性和一致性的方面对呕吐毒素胶体金现场快速检测试剂盒性能进行评价，以期为呕吐毒素胶体金快速检测产品的质量和检测可靠性评价提供技术参考。
1 材料与方法
1.1 主要材料与试剂
本试验选取2019年收获小麦和玉米作为试样。呕吐毒素标准品(编号：GBW(E)100304)、玉米赤霉烯酮标准品(编号：GBW(E) 100301)黄曲霉毒素B1标准品(编号：GBW(E) 100302)和赭曲霉毒素A标准品(编号：GBW(E) 100303)购于国家粮食局科学研究院。试验用水为超纯水，甲醇和*腈乙**为色谱纯(德国默克)。胶体金呕吐毒素快速检测盒生产批号为S00J018。
1.2 仪器与设备
伯利恒BLH—560K高速全自动锤式旋风磨；梅特勒—托利多AL204—IC天平(d=0.0001 g)；艾本森MixPlus涡旋震荡仪；Sigma2—16PX离心机；安捷伦1260型高效液相色谱仪(配备紫外检测器)。
1.3 检测方法
1.3.1 呕吐毒素胶体金快速检测
样品处理：称取1.00 土0.05 g粉碎样品于10mL离心管中，加人5.0 mL呕吐毒素提取液，涡旋震荡3min，4000r/min离心3min，取50μL上清液于2 mL离心管中，加人1000μL样本稀释液，混匀。
样品检测：移取100 μL待测液至加样孔中，加样5~8 min后可目测判断结果。若检测线(T线)显色比质控线(C线)深或一样深，表示样本中不含呕吐毒素或其浓度低于检测限(阴性)；若T线比C线浅或无显色，表示样本中呕吐毒素浓度高于检测限(阳性)；若C线不显色则表明存在不正确操作或检测卡变质，检测结果无效。
1.3.2 高效液相色谱法检测玉米呕吐毒素含量
依据GB5009.111—2016《食品安全国家标准食品中脱氧雪腐镰刀菌烯醇及其乙酰化衍生物的测定》的第二法验证小麦和玉米样品呕吐毒素含量。液相色谱条件:流动相为水—甲醇—*腈乙**(体积比为70：15：15)，流速为0.8 mL/min, C18柱(25 cmx4.6 mmX5μm)，柱温35°C，进样体积为50μL,检测波长为218 nm。
2 结果与分析
2.1 灵敏度
使用胶体金快速检测试剂盒检测含量相当于0、200、500、1000、2 000和5 000 μg/kg的呕吐毒素标准品结果如图1，随着呕吐毒素浓度增加，T线颜色变浅。对于含量大于或等于食品中呕吐毒素限量(1000 μg/kg)标准品T线颜色明显浅于C线，呈阳性；对于含量相当于5 000 μug/kg浓度的标准品T线依然有显色，说明该试剂盒检测呕吐毒素含量极限大于5000μgkg，能够满足市面检测要求。
2.2 特异性
抗体能与目标物结构相似物质发生交叉反应，造成结果假阳性率高，使得胶体金测试卡特异性差。小麦和玉米易受多种真菌毒素污染，因此试验利用试剂盒分别检测空白对照样品及浓度为100ng/mL的黄曲霉毒素B1、玉米赤霉烯酮和赭曲霉毒素A标准品，以考察测试卡的特异性，结果如图2。检测黄曲霉毒素B1、玉米赤霉烯酮和赭曲霉毒素A标准品的T线颜色与空白对照相近(阴性)，说明该测试卡与黄曲霉毒素B1、玉米赤霉烯酮和赭曲霉毒素A无交叉反应，该呕吐毒素胶体金快速检测试剂卡检测受非目标真菌毒素干扰较少，特异性强。
2.3 重复性
为评价试剂盒重复性，利用试剂盒分别检测含量为500 μg/kg的玉米样品和2 400 μg/kg的小麦样品，每个样品重复6次，结果如图3。检测500 μg/kg的玉米样品的T线颜色深于C线或相近，检测结果均为阴性；检测2 200 μg/kg的小麦样品检测T线颜色均明显浅于C线，检测结果均为阳性；总体误判率为0% ，该试剂盒重复性符合技术要求。
2.4 与仲裁方法一致性
利用胶体金快速检测试剂盒和免疫亲和层析净化高效液相色谱(HPLC)法(参比方法)分别检测16个小麦和玉米样品的呕吐毒素含量，并根据《食品快速检测方法评价技术规范》计算胶体金试剂盒检测结果的显著性差异(x2)、假阴性率、假阳性率和相对准确率(表1)。胶体金试剂盒对小麦和玉米样品检测结果的显著性差异(x2)分别为0.5和0(x2<3.84)，说明两种方法的阳性确证比率在95%置信区间内没有显著性差异。胶体金试剂盒检测小麦和玉米样品的假阴性率均为0%；对小麦和玉米样品假阳性率分别为13%和6%；总体误判率小于15%，符合LS/T 6110—2014《粮油检测谷物中脱氧雪腐镰刀菌烯醇测定胶体金快速测试卡法》的准确性要求。利用胶体金法颜色的变化难以识别小范围内抗原浓度的变化，且检验人员间对颜色的敏感程度不同，是导致胶体金法出现假阳性检测结果的重要原因。在实际操作中，对难以判别的样品可借助读数仪判别、多次重复检测或利用免疫亲和层析净化高效液相色谱法复检，以减少误判，提高检测准确性。
3 结论
利用呕吐毒素胶体金快速检测试剂盒能在短时间(30min)内获得15个以上样品的较准确的检测结果，检测结果与参比方法一致性好，重复性佳，并且无需借助大型仪器。该方法可以有效缩短呕吐毒素检测时间，减轻检测人员工作负担，适合大批量样品现场筛查，实现粮谷呕吐毒素污染风险快速预警。