第一章 N-甲基-D-天冬氨酸受体对心脏电生
理和应激相关性心律失常的影响及机制研究
引言
心脏电生理活动是心脏生理功能的基石，由窦房结发出的电信号通过有序的传导触发心脏机械活动，完成一次正常的心动周期。心脏电生理活动紊乱所导致的心律失常是心血管系统十分常见的疾病，既可发生于有心脏病的患者，也可发生于心脏结构正常的人群中。心律失常轻者无症状，重者致残、致死。据统计，我国的心房颤动(atrial fibrillation，AF)患病率为0.77%，住院AF患者的脑卒中发生率为24.8%；每年约有90万人发生恶性室性心律失常，有54万人发生心脏性猝死(sudden cardiac death，SCD)。既往心律失常抑制实验(CAST)证实，基于单纯离子通道干预靶点的抗心律失常药物，由于其致心律失常等不良反应，不能达到心律失常的治疗终点，逐渐被临床所淘汰。近来，由黄从新教授等提出从心电生物学角度，在心律失常发生的上游机制寻找靶点进行研究，为心律失常的研究提供了新的思路和方向。
N-甲基-D-天冬氨酸受体(NMDAR)是广泛分布于心脏中的谷氨酸离子型受体，有NR1、NR2和NR3三种亚基，主要位于心房肌、心室肌、传导系统、心脏内在神经纤维和神经节细胞，并与工作心肌细胞闰盘非常接近，受体能与多种配体结合，主要介导Ca2+内流，从而发挥功能。研究发现NMDAR与心肌缺血再灌注、心肌梗死和心肌病诱发的心律失常和SCD密切相关，抑制NMDAR能够有效防治上述心律失常。然而NMDAR与心脏电生理的关系还未进行深入研究，其具体的机制还不清楚。
我们前期预研究也发现，在慢性应激模型大鼠的心脏中，NMDAR表达上调，与其电生理改变密切相关。情绪或环境应激是心血管疾病的重要病因或诱因，研究也发现应激是房性和室性心律失常的重要危险因素，然而其具体分子机制却未阐明。为此，我们提出NMDAR可能在应激导致的心电生理改变中有关键作用的结论。
鉴于NMDAR的结构特点、功能特性，以及既往研究的结果，我们推测NMDAR可能是调节心电生理功能的重要位点，参与了心律失常的发生过程。为此，本研究通过抑制或激活NDMAR，在离体和整体水平上，探讨其对心房和心室的电生理特性，以及对自主神经功能的影响。并采用慢性应激模型，探讨NMDAR与慢性应激相关的心律失常的关系及其具体机制。试图全面系统地探讨NMDAR与心脏电生理活动的关系，为心电生理研究提供新思路，并为心律失常的防治提供新靶点。
第一节 慢性激活NMDAR对心室肌电生理活动的影响及其机制
恶性室性心律失常(ventricular arrhythmia，VA)如室性心动过速(ventricular tachycardia，VT)和心室颤动(ventricular fibrillation，VF)是SCD的主要病因。我国每年约有54万人发生SCD，发病率与年龄呈正相关，大于35岁的成年人每年SCD的发生率为1/1000，器质性心脏病患者发生SCD的风险更高；然而，只有少于5%的院外心搏骤停患者得以幸存，SCD严重危害了人们的生命健康，并给社会公共卫生带来了巨大的负担。尽管器械治疗和射频消融技术有长足发展，但是远未达到治疗室性心律失常的理想目标。既往CAST研究结果表明，心律失常发生的下游位点(离子通道)干预显著增加患者的死亡率，不能达到心律失常治疗的临床终点。上述研究结果均提示室性心律失常发生机制和心电生理活动的调控网络复杂，具体机制还不十分清楚，可能需要从更广阔的上游调控系统中寻找相关靶点。
NMDAR在心室肌中丰富表达，介导Ca2+内流，可能参与心室肌电生理活动。先前研究发现，缺血再灌注时心脏的NMDAR表达增加，抑制NMDAR活性能够显著抑制再灌注诱发的室性心律失常；心肌梗死(myocardial infarction，MI)后心脏对NMDA敏感，离体灌注NMDA能够诱发持续性VT；给予NMDAR的*制剂抑**治疗一周，可显著降低心肌病模型大鼠发生SCD的风险。上述结果提示NMDAR参与了心室肌电生理活动，并与室性心律失常的发生发展密切相关。然而，其与心室肌电生理特性的关系还未进行细致的研究。为此，本部分通过慢性激活NMDAR，研究在体和离体状态下心室肌电生理活动的变化，探讨相关分子机制，以期阐明NMDAR与心室肌电生理活动的具体关系。
一、材料与方法
1. 实验动物 清洁级的Wistar雄性大鼠45只，体重在280~300 g，均购于湖北省疾病预防控制中心，均在温度、湿度恒定，且昼夜交替(12 h)的环境中饲养。在新环境中预饲养3天后，将动物随机均分为3组：对照组(CTL组)、NMDA组(N组)和NMDA+MK-801组(N+M组)。三组动物分别给予0.9%的生理盐水(1 mL/kg)、NMDA(特异性NMDAR激动剂，3 mg/(mL·kg))和NMDA+MK-801(特异性NMDAR*制剂抑**，0.5 mg/(mL·kg))，均经腹腔持续注射14天。
2. 体表ECG记录 2周的药物干预完成后，用戊巴比妥钠(40 mg/kg，Sigma公司)经腹腔麻醉动物直到深麻醉。深麻醉经四肢疼痛反应消失证实。按体表ECGⅡ导联的标准连接电极于动物肢体皮下，进行记录，每只动物记录15 min(PowerLab系统，AD公司)。测量和分析基础ECG参数：心率(HR)，RR、PR、QT、QTc和TpTe间期。QTc的计算公式为
。
3. 超声心动图 同在深麻醉状态下，行超声心动图(Vevo770，Visual Sonics公司)测量左心室的结构和收缩功能。经二尖瓣乳头肌水平，测量左心室二维长轴和短轴水平的运动图像。测量下列心功能参数：左心室舒张末期直径(LVEDD)、左心室收缩末期直径(LVESD)、左心室射血分数(LVEF)和短轴缩短率(FS)。每只动物取3～5个合格的图像进行测量，并取平均值用于最终分析。
4. 离体心脏准备 大鼠在深麻醉和肝素钠(400 U/只)抗凝10 min后，采用脱臼法迅速处死，开胸分离心脏，按Langerdorff技术进行离体灌流。灌流压力为70～90 cmH2O，温度为37 ℃。灌流液为HEPES缓冲液中的Tyrode’s液：NaCl，135 mmol/L；KCl，5.4 mmol/L；CaCl2，1.8 mmol/L；MgCl2，1 mmol/L；Na2HPO4，0.3 mmol/L；HEPES，10 mmol/L；葡萄糖，10 mmol/L。用NaOH将pH校正为7.4。每个心脏在进行下一步实验前先预灌流20 min，让其恢复到稳定的状态。排除不能恢复自主节律和发生不可逆性心肌缺血的心脏。
5. 程序起搏刺激 用自制的Ag-AgCl电极(直径：0.25 mm，宽度：0.5 mm)记录单向动作电位(monophasic action potential，MAP)，将铂金电极(直径：0.25 mm，宽度：1 mm)置于右心室流出道作为刺激电极。均以2 ms的方波和2倍舒张期阈值进行起搏刺激，所有信号均由PowerLab系统经0.3 Hz～1 kHz放大和过滤。
6. 复极特性分析
(1) 动作电位时程(action potential duration，APD)和有效不应期(effective refractory period，ERP)：运用经典的S1S2刺激模式测量左心室四个部位的APD和ERP：左心室前壁基底部(left anterior base，LAB)、左心室后壁基底部(left posterior base，LPB)、左心室前壁心尖部(left anterior apices，LAA)和左心室后壁心尖部(left posterior apices，LPA)。S1S2刺激模式：8个300 ms周长的S1基础刺激，伴随一个周长连续减小的S2刺激。根据Franz’s的标准分析APD，包括APD20、APD50和APD90。将APD和ERP的变异系数(coefficient of variation，COV)定义为各自的空间离散度：SD/mean。以ERP/APD90评价APD的组分。
(2) APD交替(alternans，ALT)和每搏变异度(beat-to-beat variability，BVR)：用动态刺激模式S1S1程序测量ALT和BVR，评价左心室的复极频率适应性。S1S1刺激模式：100个S1刺激左心室前游离壁(left anterior free，LAF)，每组刺激持续15 s以维持稳定状态，相邻两组刺激间隔30 s以消除起搏记忆，如果发生VAs，则阻断5~10 min以维持心电恢复。APD定义为连续的APD90差值大于5 ms以上。用最后起搏程序时稳定状态下连续31个APD计算BVR，包括短时程变异度(shortterm variability，STV)和长时程变异度(longterm variability，LTV)。
(3) VAs诱发率：用S1S1和Burst刺激程序测量VAs诱发率。Burst刺激程序：给予LAF持续2 s的50 Hz的起搏刺激，若未诱发VAs，则重复刺激3次。VAs定义为大于2 s的连续快速或紊乱的室性电信号。根据临床标准将刺激诱发的2~30 s的VAs定义为非持续性VAs，大于30 s的VAs定义为持续性VAs。
7. Masson染色 在电生理实验完成后，进行心脏称重，然后将心脏固定在10%的多聚甲醛中直至Masson染色。具体步骤如下。
(1) 石蜡切片脱蜡至水。
(2) 依次用自来水、蒸馏水洗片。
(3) 用Weigert苏木精液染核5~10 min。
(4) 充分水洗。
(5) 蒸馏水洗。
(6) 使用Masson丽春红酸性复红液染色5~10 min。
(7) 以2%的冰醋酸水溶液浸洗片刻。
(8) 以1%的磷钼酸水溶液分化3~5 min。
(9) 苯胺蓝染色液染色5 min。
(10) 以0.2%冰醋酸水溶液浸洗片刻。
(11) 95%酒精(又称乙醇)、无水酒精脱水，二甲苯透明、中性树胶封固。
胶原纤维呈蓝色、心肌纤维呈红色、细胞核呈黑蓝色。用定量分析软件(Image ProPlus 6.0，IPP6.0)计算心肌纤维化分数：每张片子随机选取5～10个视野，计算蓝染组织占整张片子的百分比。
8. Western Blot分析 动物在深麻醉后快速处死，取出心脏，分离左心室，经液氮冷冻后，储藏在-80 ℃冰箱中备用。Western Blot分析的具体步骤如下。
(1) 蛋白提取：于-80 ℃取出所需样本，放入干冰中。每个EP管放入3~4颗*珠钢**，放入干冰中预冷。用眼科剪剪下所需样本放入对应的EP管，称重并记录每个样本的重量。裂解液中加入苯甲基磺酰氟(PMSF,要摇匀至无结晶才能与裂解液混合)，混匀。加入相应量的裂解液到样品中，为防止温度过低使裂解液凝固冻住*珠钢**，加入裂解液后应迅速摇匀。匀浆器匀浆直至完全裂解。吸取澄清液体转移到新的EP管中继续离心。参数设置为5 min，4 ℃，14000 r/min。准确吸取清液并定量，记录每个样本的裂解体积。注意：吸取澄清液体时注意切勿接触沉渣及上层白色漂浮物。
(2) 蛋白定量(BCA法)
①准备工作液：按(200 μL partA+4 μL partB)/孔配制：所需A液的体积为(N+6)×400 μL+200 μL。B液的体积为A液的1/50。N为被检测样品数目。A液和B液混匀，低温放置备用。
②准备被检测样品：将提取的样品取出4 μL加入116 μL的双蒸水中震荡混匀。(组织样品稀释30倍，细胞样品稀释15倍)。
③准备标准品，按照以下表格，在500 μL EP管中，对标准品进行稀释(表1-1)。
④吸取稀释好的标准品或被测样品25 μL加入96孔板中，每份样品做2个复孔。加入200 μL的工作液。
⑤至37 ℃温箱中孵育30 min。
⑥取出96孔板冷却至室温，在562 nm处检测吸光度。
⑦根据结果加入相应量的10×DTT、“水”和4×Loading Buffer将总蛋白校准到同一浓度。DTT为终体积的1/10，LB为终体积的1/4。“水”为与裂解液的配方中RIPA等体积的双蒸水。
(3) 蛋白变性：蛋白样品于12000 r/min瞬离，分装样品，72 ℃水浴10 min(每2~3 min翻动一次)，置于-80 ℃保存。
(4) SDS-PAGE胶的制备
①下层分离胶的制备：根据待测的目的蛋白的相对分子质量，选择不同的凝胶浓度，因为Kv4.2、Kv4.3、KChIP2、NMDAR1和GAPOH的相对分子质量分别为71、71、29、105、37kDa，故选用10%和15%的凝胶。
a.清洗厚薄玻璃板各一块，晾干。
b.对齐玻璃板放入夹中，卡紧，然后垂直卡在架子上。灌满双蒸水等待10 min看水位是否下降，如不漏液，将水倒出，用滤纸吸干，准备灌分离胶。
c.按要求配制适当浓度的分离胶。一块凝胶约需要5 mL的凝胶液。液面高度大概为5 cm。不能太高也不能太低。
d.灌入凝胶液后，在其上慢慢加入一层乙醇。
e.待胶凝固后，倒出乙醇，吸干，准备灌浓缩凝胶液。
f.按要求配制浓缩胶，每块需要约2 mL的浓缩凝胶液，灌满后迅速从一边斜插入梳子。整个过程尽量赶出板内的气泡，等待凝固。
按表1-2配制不同浓度的分离胶，待下层胶凝固后，再进行上层浓缩胶的配制。
②上层浓缩胶的配制：根据需要，按表1-3配制浓缩胶，并插好梳子。
(5) 上样及电泳
①上样：将配制好的凝胶板架在电泳槽中，加入电泳内液和电泳外液。每个电泳槽需200 mL电泳内液。电泳外液需要灌满电泳槽体积的2/3。电泳内液需现配现用。每孔上样量为25 μg蛋白，点样完成后开始电泳。数据记录于表格。
②电泳：一般浓缩胶电压设为80 V，时间设为20 min，分离胶电压设为120 V，时间设为60 min，需要根据具体实验要求调整电压和时间。当染料到达胶底部时，停止电泳，进行下一步转膜。
(6) 转膜
①按要求配制转膜液于4 ℃预冷。
②按8 cm×5.9 cm裁剪好PVDF膜并在一角剪个缺口作为膜的左上角，使用前在甲醇中浸泡15 s后放入转膜液中备用。
③将夹板左右摊开，负极向右。黑色的一边为负极，白色为正极。两边各铺上2块海绵和5张滤纸(海绵和滤纸预先用转移缓冲液浸湿)。
④取出凝胶板中的凝胶，去除多余部分。用转膜液洗涤凝胶，将凝胶平铺在负极的滤纸上，赶走气泡，将PVDF膜覆盖其上，剪缺口的地方应与大Marker的一角对齐，赶走气泡后覆盖左边的滤纸及海绵(不能有气泡)，夹上夹板。
⑤将夹板放入转膜槽中，转膜槽的负极(黑色面)应与夹板的负极(黑色面)放在一起，灌满转膜液以淹没凝胶。
⑥转膜槽接通电源，电压设为250 V，电流设为0.2 A。开始电泳转移，起始电压应大于100 V，如果低于100 V，可适当调高电流至所需电压，转移时间为1.5 h。数据记录于表格。
⑦转移结束后，取出PVDF膜。
(7) 膜上蛋白的检测：用丽春红染色工作液染色检测转膜是否成功。
①丽春红染色工作液：2%的丽春红储备液1∶10稀释(加9倍的双蒸水)。
②染色方法：将膜放入TBST洗一次，再置于丽春红染色工作液中，在室温下摇动染色5 min，用大量的水洗膜直至水变清、无色蛋白条带清晰，PVDF膜需用甲醇再活化后再用TBST洗涤，后进行封闭。
(8) 膜的封闭及抗体孵育
①封闭：把蛋白膜放置到预先准备好的TBST中，洗去膜上的转膜液。蛋白膜放入封闭液中，在摇床上缓慢摇动，室温封闭1~4 h。
②一抗：根据说明书Kv4.2 1∶1000、 Kv4.3 1∶1000、KChIP2 1∶1000、NMDAR1 1∶1000、 GAPDH 1∶1500 稀释抗体，利用封口机将薄膜封入杂交袋中，加上一抗，封口。尽可能不留空气。将杂交袋放入4 ℃摇床中，过夜。
③二抗：将薄膜取出，用TBST洗涤3次，每次5 min。回收一抗。将膜放入对应的加有二抗的二抗稀释液中，避光孵育1 h。8 mL二抗稀释液中加入0.6 μL的二抗。
(9) 显色(ECL发光法)首先配制ECL发光液：取ECL发光液A和B等量混匀，加在膜的正面暗室避光5 min。倒掉显色液，用纸小心吸取显色液，在膜上面覆盖一层平整的透明纸。在暗室中，打开红外灯，取出感光胶片做好标记，轻轻地放在膜上，显色30～60 s，拿开胶片立即完全浸入显影液中1～2 min，再放入定影液中1 min，离开暗室观察结果。根据条带强弱，再次感光以达到理想结果。
9. 统计分析所有数据均用SPSS 17.0软件分析，连续变量用平均数±标准差或中位数表示，组间比较采用独立样本t检验；计数资料用百分数描述，两组间比较采用χ2检验；将P≤0.05定义为差异有统计学意义。
二、结果
1. 体重和超声心动图结果 为研究NMDAR慢性激活是否影响心脏结构和功能，在给药两周后，我们比较了动物心脏重量和左心室功能。结果显示，CTL组、N组和N+M组动物的体重(body weight，BW)、心脏重量(heart weight，HW)和HW/BW均相近，差异无统计学意义(P>0.05)，见表1-4。超声心动图显示，左心室大小(LVEDD和LVESD)和运动功能(LVEF和FS)在三组间也相近，差异也无统计学意义(P>0.05)，见表1-4。
注：BW，body weight，体重；HW：heart weight，心脏重量；LVEDD，left ventricular end-diastolic dimension，左心室舒张末期直径；LVESD，left ventricular end-systolic dimension，左心室收缩末期直径；LVEF，left ventricular ejection fraction，左心室射血分数；FS，fractional shortening，短轴缩短率。
2. 体表ECG结果 在麻醉状态下，体表Ⅱ导联ECG记录显示，N组有3只动物发生了室性期前收缩(premature ventricular contraction，PVC)，而CTL组和N+M组均无PVC发生。与CTL组相比，N组动物的HR较快((398±9)次/分vs(361±11)次/分，P<0.05)、RR间期较短((152±3) ms vs (167±5) ms，P<0.05)、QT间期延长((62±1) ms vs (49±2) ms，P<0.01)、QTc间期延长((36±2) ms vs (25±2) ms，P<0.01)、TpTe间期也延长((35±3) ms vs (24±2) ms，P<0.01)，而PR间期无明显改变((45±2) ms vs (48±2) ms，P>0.05)，见图1-1。与CTL组相比，N+M组动物ECG未出现明显改变，上述参数在两组之间的差异均无显著的统计学意义(P>0.05)，见图1-1。
图1-1 慢性激活NMDAR导致体表ECG异常
注：(a)三组动物典型的ECG(Ⅱ导联)图形，N组大鼠发生了室性期前收缩；(b)与CTL组相比，N组大鼠的心率较快，RR间期较短，QT、QTc和TpTe间期延长。P值为N组与CTL组相比。
3. 复极特性比较 在离体状态下，我们测量了左心室复极特性，与在体记录的ECG结果相一致，N组动物的复极时程和形态均有显著变化。与CTL组相比，N组的APD显著延长：APD20((19.27±1.46) ms vs (15.57±1.92) ms，P<0.05)、APD50((62.64±2.53) ms vs (50.57±2.30) ms，P<0.01)和APD90((93.14±2.82) ms vs (77.68±3.75) ms，P<0.05)，见图1-2；而N+M组的APD无显著改变，APD20、APD50和APD90分别为(16.67±1.65) ms、(53.20±1.99) ms和(79.39±1.09) ms。
N组左心室ERP与CTL组相近((45.5±1.6) ms vs (48.6±2.4) ms)，差异无统计学意义(P=0.14)，而ERP/APD90显著减小((48.1±1.0)% vs (61.7±2.2)%)，差异有统计学意义(P<0.01)。N组左心室复极离散度均显著大于CTL组，包括COVAPD((10.6±0.9)% vs (3.2±0.8)%)、COVERP((22.1±2.6)% vs (3.7±0.3)%)和COVERP/APD((12.6±1.4)% vs (5.2±0.3)%)，差异均有统计学意义(P<0.01)。而N+M组的左心室复极离散度未显著改变，COVAPD、COVERP和COVERP/APD分别为(4.7±0.2)%、(7.2±0.5)%和(5.5±0.4)%，与CTL组相比，差异无统计学意义(P>0.05)，见图1-2。
图1-2 慢性激活NMDAR导致APD波形异常
注：(a)和(b)，与CTL组相比，N组的APD延长；(c)和(d)，APD90、ERP和ERP/APD90的空间离散度增大；(e)ERP无明显变化；(f)ERP/APD90减小。P值为N组与CTL组比较。
4. ALT和BVR 在S1S1刺激模式下，三组动物均发生了ALT。N组发生ALT的起搏周长显著大于CTL组(中位数：110 ms vs 90 ms，P<0.01)；而N+M组发生ALT的周长为100 ms，见图1-3。N组的BVR显著大于CTL组：STV((9.43 ± 0.92) ms vs (2.41 ± 0.20) ms，P<0.01)和LTV((5.24 ± 0.51) ms vs (1.15 ±0.10) ms，P<0.01)，见图1-3。
图1-3 慢性激活NMDAR增加APD交替和BVR
注：(a)各组S1S1起搏模式下典型的APD交替图形；(b)与CTL组相比，N组APD交替的起搏周长显著延长；(c)起搏结束前，各组典型的31个APD90动态变化；(d)和(e)，与CTL组相比，N组的 BVR 显著增大，包括STV和LTV。P值为N组与CTL组比较
5. VAs易感性 在S1S1和Burst刺激模式下，N组的VAs易感性均显著高于CTL组。S1S1动态刺激下，N组90%的动物可以诱发VAs，而CTL组的诱发率只有10%，N+M组的诱发率为30%，差异有统计学意义(P<0.01)。Burst超速刺激下，N组VAs诱发率为100%，CTL组为20%，N+M组为40%，差异也有统计学意义(P<0.01)。持续性VAs诱发率在N组、N+M组和CTL组分别为80%、20%和0，差异有统计学意义(P<0.01)，见图1-4。
图1-4 慢性激活NMDAR增加VAs易感性
注：(a)各组Burst刺激诱发的典型图形；(b)、(c)、(d)，与CTL组相比，N组的VAs诱发率显著增加。P值为N组与CTL组比较。
6. 心肌纤维化和通道蛋白表达 Masson染色显示，NMDA给药2周后，左心室心肌出现了轻度的纤维化。N组的纤维化指数显著高于CTL组((3.63 ± 0.17)% vs (1.53 ±0.16)%，P<0.01)，而N+M组未发现明显的纤维化，见图1-5。
图1-5 慢性激活NMDAR导致心肌轻度纤维化
注：箭头代表心肌纤维染色阳性区；(b)为N组与CTL组比较P<0.01。Western Blot检测显示，N组的复极相关钾通道蛋白下调，包括Kv4.2、Kv4.3、KChIP2、Kv11.1，而Cav1.2和NMDAR1无明显改变，见图1-6和图1-7。
图1-6 慢性激活NMDAR下调左心室复极相关钾通道蛋白
注：P值为N组与CTL组比较。
图1-7 左心室NMDAR的表达
注：P值为N组与CTL组比较。
三、讨论
NMDAR具有受体和离子通道的双重特性，既往研究主要集中在中枢神经系统。近年来，研究者发现NDMAR也丰富地表达于心脏各部位，并且参与了心律失常的发生过程。因此，我们假设NMDAR可能是心脏电生理活动的重要调控分子。与此假设一致的是，本研究发现慢性激活NMDAR 2周后，心室复极时程延长，复极的空间和时间离散度显著增加，导致心脏电生理活动不稳定，使VAs的易感性显著增加。在机制上，上述心脏电生理活动的变化主要与复极相关钾通道蛋白下调、心肌纤维化相关。
1. NMDAR与心室复极特性 NMDAR对Ca2+具有高度的通透性，Cao等证实用10-5mol的NMDA培养新生大鼠心肌细胞会导致细胞内的Ca2+浓度呈可逆性增加，将浓度提高到10-4mol，则会引起钙超载。Ca2+是心脏电生理活动的重要离子，具有调节心肌兴奋性的功能。慢性激活NMDAR使心肌细胞内Ca2+增加，将使心肌的可兴奋性增加。本研究发现，N组动物的HR增加11%，提示NMDAR的激活显著增加心脏的可兴奋性。
此外，体表ECG显示，慢性激活NMDAR后动物的QT间期、QTc间期、TpTe间期和APD均显著延长，表明心室复极时程明显延长。在离体状态下，我们检测了左心室四个代表部位的复极特性，综合分析发现，NMDAR的慢性激活使心室复极离散度显著增加。TpTe间期反映心肌跨壁复极离散度，也提示心室内外膜的空间复极差异。本研究中，我们进一步评价了复极动态特性和电生理活动的稳定性。在生理状态下，APD的动态变化与HR相适应，称为复极储备；HR增加时，APD缩短；HR降低时，APD延长。在缺血等情况下，APD的每搏变异度显著增加，与心率变化不匹配，复极储备下降，将会导致心脏电生理活动不稳定，形成功能性传导阻滞。ALT是指连续相邻的APD差异明显增加；如果空间上发生不协调的ALT，将会导致折返发生。本研究中，NMDAR的慢性激活降低心室复极储备和ALT阈值，提示心室复极的频率适应性和稳定性下降。
为了进一步探讨相关分子机制，我们检测了形成复极电流(包括Ito、Ica，L和Ikr)的复极相关钾通道蛋白。结果显示NMDAR慢性激活使Kv4.2、Kv4.3、KChIP2和Kv11.1蛋白下调。Kv4.2和Kv4.3是形成Ito，f电流的亚基蛋白，而KChIP2作为β亚基，主要调节Ito相关蛋白的转运和定位。Ito，f相关蛋白作为大鼠心室肌Ito通道蛋白最主要的组成部分，是心室复极活动中的关键通道，与复极时程和动态变化密切相关。Ito，f下降将显著延长APD和QT间期，增加复极离散度，促进ALT。而Kv11.1构成快速激活外向整流性电流Ikr，Ikr是调节心室复极动态适应性的关键电流，Ikr下降会导致心室复极储备下降。
2. NMDAR和VAs Lu等报道NMDA灌流诱发缺血再灌注相关VAs；D’Amico等发现NMDAR*制剂抑**(MK-801、氯胺酮和美金刚)可降低缺血再灌注相关VAs的发生率，以及显著减少心肌病大鼠发生SCD的风险。然而，未有研究探讨慢性激活NMDAR与VAs易感性的关系。
本研究中，在麻醉状态下，N组大鼠出现了PVC。深入研究发现，在离体状态下，S1S1和Burst两种刺激模式下，N组大鼠的VAs易感性显著升高。我们的结果提示，慢性激活NMDAR为VAs的发生提供了基础，使VAs风险增加。
复极不稳定可能是NMDAR增加VAs发生的重要机制。因为复极的时空离散度会导致复极顺序紊乱，从而引起传导阻滞和折返，最终增加心律失常的易感性。另外，复极的频率适应性下降也会引起折返性心律失常的发生。而且，NMDAR激活导致心肌细胞Ca2+大量内流，会使钙超载和运作紊乱，增加触发活动和心律失常的概率。
除了上述电重构改变外，心肌纤维化也是一个重要机制。心肌纤维化通过多种机制促使心律失常发生。纤维化损害心肌细胞电耦联，导致电传导不均一和不对称，从而减慢电传导，增加碎裂波和转子的组织易感性，是单向传导阻滞和折返性心律失常发生的重要机制。而NMDAR导致心肌纤维化的机制也可能与钙超载有关，因为大量Ca2+内流时，会导致线粒体功能损害，诱发细胞凋亡。既往研究表明，用NMDA培养心肌细胞，会激活凋亡通路，促使心肌细胞凋亡。
四、结论
慢性激活NMDAR使Kv4.2、 Kv4.3、 KChIP2和 Kv11.1蛋白下调，心室肌轻度纤维化，导致心室复极时程延长，电生理活动不稳定，最终使VAs易感性显著增加。
第二节 慢性激活NMDAR对心率变异性和房性心律失常的影响
在大鼠、猴子和人类心脏中，NMDAR不仅表达于心室肌，在心房肌和心脏内在神经上也有丰富的分布，如神经末梢和神经节。NMDAR与心脏自主神经功能的关系密切，研究发现，激活杏仁核和延髓头端腹外侧区的NMDAR显著增加内脏和腰椎交感神经的输出；在心脏交感神经增生的模型中，心脏NMDAR表达上调，激活NMDAR能够诱发VT和VF。然而，NMDAR与心率变异性(heart rate variability，HRV)的关系还不清楚。HRV受支配窦房结的自主神经调控。HRV作为非侵入性电生理指标，能够较准确地反映心脏自主神经功能，并能预测心律失常和SCD的发生。
另外，NMDAR与心房肌电生理活动的关系也未见报道，NMDAR在心房肌的表达较心室肌丰富，心房表面分布有许多自主神经和心脏内在神经纤维，心房肌电生理活动更易受到自主神经的影响，结合上节内容，强烈提示慢性激活NMDAR可能会导致心房电重构，增加AF的易感性。为此，本部分进一步探讨NMDAR的慢性激活与HRV和心房肌电生理活动的关系，以期全面理解NMDAR与心电生理功能的关系。
一、材料与方法
1. 实验动物 清洁级的Wistar大鼠45只，体重在280~300 g，均购于湖北省疾病预防控制中心，均在温度、湿度恒定，且昼夜交替(12 h)的环境中饲养。在新环境中预饲养3天后，将动物随机均分为3组：对照组(CTL组)、NMDA组(N组)和NMDA+MK-801组(N+M组)。三组动物分别给予0.9%的生理盐水(1 mL/kg)、NMDA(特异性NMDAR激动剂，3 mg/(mL·kg))和NMDA+MK-801(特异性NMDAR*制剂抑**，0.5 mg/(mL·kg))，均经腹腔持续注射14天。
2. 遥测心电图和HRV分析 大鼠经1%的水合氯醛(0.3 mL/kg，Sigma公司)深麻醉(深麻醉经四肢疼痛反应消失证实)后，置于37 ℃恒温加热板固定四肢。在下腹部右侧钝性分离皮下组织，形成囊袋，将植入子(型号EA-F40，DSI公司)体部置入囊袋，再将阳性和阴性电极按体表Ⅱ导联的标准位置分别固定在右侧肩部和左侧腹股沟皮下。接收器(RMC-1)置入每只动物笼下，并与数据采集体系(Dataquest A.R.T，DSI公司)连接，增益为1000倍，滤波范围为0.05 Hz～1 kHz，信号采集频率为1000 Hz。为排除手术、外伤的干扰，在置入的3天后开始记录，每只大鼠连续记录24 h。
将记录数据经数模转换后于LabChart 7.0软件(AD公司)上进行离线分析。选取无运动干扰和心律失常的ECG节段，10 min为一段，采用时域和频域法对HRV进行分析。
(1) 时域法：计算窦性RR间期的标准差(standard deviation of normal-normal intervals，SDNN)、全部相邻RR间期差值的均方根(square root of the mean squared differences of successive RR intervals，RMSSD)。
(2) 频域法：将数据进行快速傅里叶转化(Welch’s周期图：256点，50%重复，Hamming窗口)，分析低频(low frequency，LF，0.04～0.6 Hz)和高频(high frequency，HF，0.6～2.4 Hz)，计算LF/HF。
3. 分离心脏 大鼠在深麻醉和肝素钠(400 U/只)充分抗凝10 min后，迅速处死，开胸分离心脏，按Langerdorff技术进行离体灌流。灌流压力为70～90cmH2O，温度为37℃。灌流液为HEPES缓冲的Tyrode’s液：NaCl，135mmol/L；KCl，5.4 mmol/L；CaCl2，1.8 mmol/L；MgCl2，1 mmol/L；Na2HPO4，0.3 mmol/L；HEPES，10 mmol/L；葡萄糖，10 mmol/L。用NaOH将pH校正为7.4。每只心脏在进行下一步实验前先预灌流20min，让其恢复到稳定的状态。排除不能恢复自主节律和发生不可逆性心肌缺血的心脏。
4. 心房电生理活动记录 将自制的Ag-AgCl电极(直径：0.25 mm，宽度：0.5 mm)置于左心房，记录MAP；将铂金电极(直径：0.25mm，宽度：1mm)置于右心耳作为刺激电极。均以2ms的方波和2倍舒张期阈值进行起搏刺激，所有信号均由PowerLab系统经0.3 Hz～1 kHz放大和过滤。
(1) 程控刺激：在基线水平记录10 min后，行程控刺激，以8个稳定周长(300 ms)S1刺激，附加一个额外期前刺激(S2)，S2的周长从100 ms开始以1 ms反扫，直至心律失常或ERP。测量每个S2下的激动潜伏时程(activation latency，AL)，AL定义为S2与随后MAP的最大dV/dt处的间期。
(2) Burst刺激：以50 Hz持续刺激2 s，总共刺激3次，如果AF未诱发，则重复3次。AF定义为大于2s的连续紊乱的心房电生理活动，伴有不规则的心室电生理活动。用Spike-2软件对AF的特征进行频谱分析，包括主波频率(dominant frequency，DF)和规则指数(regularity index，RI)。
5. 免疫组化
(1) 固定心肌标本：做大鼠胸前正中切口，取出心脏，将心脏置于4%多聚甲醛溶液中固定。
(2) 石蜡包埋：固定的心脏于系列浓度乙醇中脱水，浸蜡、石蜡包埋以备用。
(3) 常规脱蜡。
(4) 以蒸馏水冲洗，磷酸盐缓冲液(PBS)浸泡5 min。
(5) 高压抗原修复。
(6) 3%去离子水，孵育10 min，以消除内源性过氧化物酶活性。
(7) 滴加正常山羊血清工作液，室温孵育15 min。
(8) 滴加适当比例稀释的一抗，37 ℃孵育3 h。
(9) PBS冲洗3 min，共3次。
(10) 滴加荧光素标记的兔抗鼠IgG试剂，37 ℃孵育15 min。
(11) PBS冲洗3 min，共3次。
(12) 荧光显微镜下观察，拍照。
切片置于Olympus BX51显微系统，先于10倍物镜下观察挑选，然后在40倍物镜下放大，利用IPP 6.0(Media Cybernetics公司)图像分析系统进行拍摄，保存图像文件并编号。将编号的图像文件以IPP 6.0软件进行最佳平衡、图像增强等处理后，进行图像分割操作，在HIS模式下将图像中阳性的免疫组织和阴性的绿染组织以及黑色的背景分隔开，计算免疫组织占总组织视野的百分比，以Area(%)表示。
6. 天狼星红染色 在电生理实验完成后，将心脏置于PBS中清洗，分离、修剪心房组织，然后置入4%的多聚甲醛中处理24 h，以进行天狼星红染色(PSR)，分析心房胶原纤维的含量。
具体步骤如下。
(1) 试剂配制
①天狼星红-饱和苦味酸液：0.5%天狼星红10 mL，饱和苦味酸液90 mL。
②天青石蓝液：天青石蓝B 1.25 g，铁明矾1.25 g，蒸馏水250 mL。溶解煮沸、待冷却过滤，加入甘油30 mL，然后再加入浓盐酸0.5 mL。
(2) 染色步骤
①中性甲醛液固定组织，石蜡切片，常规脱蜡至水。
②天青石蓝液染5～10 min。
③蒸馏水洗3次。
④天狼星红饱和苦味酸液浓染15～30 min。
⑤无水乙醇直接分化与脱水。
⑥二甲苯透明，中性树胶封固。
与免疫组化相同步骤选择切片，于普通光镜下观察，胶原纤维呈红色，细胞核呈绿色，其他成分呈黄色。用IPP 6.0软件进行最佳平衡、图像增强等处理后，对胶原纤维的面积进行定量分析，计算胶原纤维百分比(红色像素/心肌纤维总面积)，以Area(%)表示。
7. Western Blot检测 同上节的Western Blot检测步骤，检测心房肌的Cx40、MMP9、NMDAR1和β肌动蛋白的表达量。
8. 统计学分析 所有数据均用SPSS 17.0软件分析，连续变量用均数±标准差或中位数表示，组间比较采用独立样本t检验；计数资料用百分数描述，两组间比较采用χ2检验；将P≤0.05定义为差异有统计学意义。
二、结果
1. 慢性激活NMDAR减低HRV 给药前，基础状态下各组动物的HRV参数相近，差异无统计学意义(P>0.05)。与对照组相比，2周的NMDA给药导致心脏自主神经功能紊乱，使HRV显著减低，主要表现为交感神经节律增加和副交感神经节律降低。以连续10 min的RR间期构成的散点图显示，N组的RR间期离散度明显小于CTL 组；定量的时域分析显示，与CTL组相比，N组的SDNN较小((5.06±0.20) ms vs (8.05±0.88) ms，P<0.01)，RMSSD也较小，((2.13±0.31) ms vs (5.12±0.71) ms，P<0.01)，见图1-8。
图1-8 HRV的时域分析结果
注：(a)三组典型的10 min RR的逐波变异的图形；(b)和(c)，与CTL组相比，N 组的HRV下降，包括SDNN和RMSSD均显著减小。*P<0.01 为与CTL 组比较。
频域分析结果显示，与CTL 组相比，N组的LF显著增大((77.47±0.48) n.u.vs (53.04±1.63) n.u，P<0.01)，HF显著减小((20.71±0.51) n.u vs (46.48±1.61) n.u，P<0.01)，LF/HF显著增加((3.82±0.10) vs (1.22 ±0.07)，P<0.01)，见图1-9。与CTL组相比，N+M组的上述HRV指标未有显著改变，差异无统计学意义(P>0.05)。
图1-9 HRV的频域分析结果
注：(a)三组典型的频域结构图形；(b)、(c)、(d)，与CTL组相比，N组的LF/HF和LF增大，而HF减小。n.u.，normalized units，标准化单位；Hz，hertz，赫兹；与CTL组比较，*P<0.01 和 ＃P<0.05。
2. AF易感性分析 在S1S2程控刺激下，N组心房的AL显著长于CTL组，在最末刺激周长下的AL显著延长((64.6±5.3) ms vs (22.8±2.4) ms，P<0.01)；在该刺激模式下，N组更容易诱发AF，而CTL组未有AF发生；此外，N组心房的ERP显著小于CTL组((22.0±1.9) ms vs (32.6±1.8) ms，P<0.01)，见图1-10。
图1-10 S1S2刺激模式下的心房电图(EG)、激动潜伏(AL)和有效不应期(ERP)
注：(a)各组在S1S2刺激模式下的典型心房EG和AF图形；(b)和(c)，与CTL组比较，N组的AL显著增加，而ERP减小。*P<0.01为与CTL组比较。
Burst刺激模式下，N组大鼠均可诱发AF，而CTL组无AF诱发(100% vs 0%，P<0.01)。虽然，N+M组的AF诱发率为50%，但是AF的持续时间显著短于N组((4.38±0.95) s vs (81.56±21.66) s，P<0.001)。频谱分析显示，与N+M组诱发的AF相比，N组的AF呈快速、相对不规则的心房电生理活动，中位数DF较大((25.88) Hz vs (15.62) Hz，P<0.01)，中位数RI较小(0.53 vs 0.91，P<0.01)，见图1-11。
图1-11 Burst刺激下的AF易感性
注：(a)各组Burst刺激下的典型心房电图(EG)图形；(c)AF诱发率的比较；(d)N组的AF持续时间显著长于N+M组；(b)、(e)、(f)AF的频谱分析，与N+M组比较，N组AF的主波频率(DF)较大，而规则指数(RI)较小。*P<0.01和＃P<0.05为与CTL组比较。
3. PSR染色
先前研究显示，2周的NMDAR激活导致心室肌轻度纤维化，因此本部分探讨心房肌是否有与心室肌同样的反应。PSR染色显示，2周的NMDAR慢性激活同样能够引起心房肌纤维化，N组的心肌纤维化程度显著高于CTL组((9.08±1.03)%vs (3.64±0.43)%，P<0.001)，见图1-12。
图1-12 心房肌纤维化
注：(a)心房肌PRS染*图色**片；(b)与CTL组相比，N组心房肌纤维化水平显著增加。箭头代表阳性染色区；*P<0.01为与CTL组比较。
4. 免疫组化和蛋白检测结果 为了进一步探讨心房电生理活动改变是否与心房肌细胞间缝隙连接蛋白下调有关，我们通过免疫组化发现，N组心房肌的Cx40阳性染色较淡，面积百分比显著小于CTL组((3.50±0.32)% vs (8.60±0.54)%，P<0.001)；Western Blot检测也显示N组的Cx40显著下调，显著低于CTL组((0.96±0.15) vs (1.86±0.21)%，P<0.001)；同时，N组的MMP9表达上调，显著高于CTL组((1.06±0.17) vs (0.67±0.14)，P＜0.001)，而两组的NMDAR1表达之间差异无统计学意义((0.73±0.06) vs (0.78±0.02)，P=0.28)，见图1-13和图1-14。
图1-13 心房肌Cx40和MMP9的表达
注：(a)心房肌Cx40的免疫组化图；(b)与CTL组相比，N组心房肌Cx40的表达面积百分比较少；(c)心房肌Cx40和MMP9的Western Blot图；(d)与CTL组相比，N组心房肌的Cx40表达下调；(e)与CTL组相比，N组心房肌的MMP9表达上调。箭头代表阳性染色区；*P<0.01为与CTL组比较。
图1-14 心房肌NMDAR1的表达
注：(a)心房肌NMDAR1的Western Blot图；(b)与CTL组相比，N组心房肌NMDAR1的表达量无明显改变。P值为CTL组和N组的比较。
三、讨论
虽然NMDAR广泛分布在心脏中，然而其与心脏电生理活动的关系研究较少。先前的研究主要聚焦在中枢神经系统，我们上部分探讨了NMDAR的慢性激活与心室肌电生理活动的关系，发现NMDAR的慢性激活可引起心室电重构，为室性心律失常的发生提供了潜在条件。鉴于NMDAR在心脏内在神经节、神经末梢和心房肌中均广泛分布，我们推测，慢性激活NMDAR可能也会显著影响自主神经对心电生理活动的调节，以及影响心房电生理活动。
1. NMDAR与HRV 虽然许多研究探讨了NMDAR与自主神经系统的关系，然而NMDAR与心脏自主神经功能、HRV的关系还未得到深入研究。我们发现，慢性激活NMDAR显著减少RR间期的每搏变化，减小SDNN和RMSSD。SDNN是RR间期的变异程度，而RMSSD是定量短时程、高频率RR变异的指标，代表HRV的迷走神经调控的部分。此外，频谱分析发现慢性激活NMDAR可导致心脏的自主神经功能紊乱，特征表现为LF/HF和LF增加，HF减小。LF/HF是反映自主神经平衡的综合指标，LF主要反映交感神经活动，而HF主要反映副交感神经的活动。上述结果提示，NMDAR的激活增加心脏交感神经的活动输出，抑制副交感神经的活动，从而导致HRV下降。
HRV与心脏自主神经系统功能的关系密切，HRV下降是心律失常和SCD的有力预测因子。HRV受神经心脏轴活动的控制，神经心脏轴包括窦房结、自主神经的外周传入和传出神经，自主神经中枢和大脑中枢神经系统，NMDAR在这条轴的每个水平均有分布，因此为联系NMDAR与HRV提供了组织基础。我们同时发现，NMDAR慢性激活使心率增快11%；Lu等的研究发现交感神经增生显著上调心室肌NMDAR的表达，而且静脉灌注NMDA能够导致心肌梗死伴交感增生模型大鼠发生VT和VF。然而，在中枢神经系统的研究结果却并不十分一致，Matsuo等在中枢神经系统微量注射NMDA，显著增加副交感神经输出，引起减压反射和心动过缓；Leung等在下丘脑室旁核微量注射NMDA，显著增加肾脏交感神经输出，使心率增快，并呈剂量依赖性；Chapp等发现杏仁核处神经元NMDAR激活或上调导致内脏交感神经和腰椎交感神经活动增加，并升高动脉压力，同样呈剂量依赖性。我们的结果提示，NMDAR的激活显著增加心脏交感神经的活动输出，降低HRV。上述结果均表明，NMDAR是自主神经活动的重要调节靶点，其结果的不一致性可能与各位点神经类型分布差异有关。
2. NMDAR与AF 与NMDAR对室性心律失常易感性的影响一致，慢性激活NMDAR引起AF相关的电重构，包括延长AL、减小ERP，并显著增加AF的易感性。Krummen等发现永久性AF患者与阵发性AF患者相比，心房的激动延迟、传导缓慢，使AL显著增加，导致APD整复曲线陡峭，为AF的发生提供了潜在的条件。ERP减小是AF患者心房电重构的重要特征，会导致心房的可激动时间和AF发生率增加，而延迟ERP的干预方法能够有效终止AF。
心房肌纤维化和缝隙连接减少也是NMDAR导致AF易感性增加的重要机制。为了进一步探讨心房结构改变的机制，我们发现NMDAR的慢性激活明显上调MMP9的表达。MMP9是一种蛋白水解酶，MMP9的激活会破坏细胞外基质蛋白，促进纤维化。心房肌纤维化是AF触发和维持的重要影响因素，纤维化干扰心脏电生理活动的连续性，并减慢传导；成纤维细胞和心肌细胞的相互作用将会触发异位电生理活动，还可导致折返发生。Cx40是心房肌重要的缝隙连接蛋白，对维持正常的电传导起着关键作用。AF患者普遍存在Cx40下调和异质性分布，并与病程呈正相关，永久性AF患者的Cx40异常程度显著高于阵发性AF患者。Cx40为心肌细胞间电传导提供了低阻力通道，Cx40表达下降或功能异常均会使AL增加，容易形成传导阻滞和触发AF。
NMDAR丰富表达于心房肌，慢性激活导致的Ca2+大量内流也是心房重构的重要机制。Ca2+是心电生理活动的关键离子，然而慢性过度的Ca2+内流会导致Ca2+运作紊乱。越来越多的研究发现Ca2+运作紊乱通过多种机制，如触发活动、折返和AF相关的重构，最终诱发AF。另外，Ca2+是重要的第二信使，激活下游信号通路，产生多种生物学效应，如导致线粒体功能异常和激活MMP9，最终导致心房重构。
四、结论
本部分探讨了NMDAR与HRV和心房电生理活动的关系，发现慢性激活NMDAR降低HRV，增加AF的易感性，这与心脏自主神经功能失调、心房电重构、心房肌纤维化和缝隙连接减少有关。
第三节 NMDAR与应激相关性心律失常的关系研究
心脏电生理活动与社会、自然环境的变化密切相关。大气污染、战争、地震、情绪突变等均可作为应激源刺激机体，引起神经内分泌系统的适应性反应，心血管系统功能和结构也会出现相应的改变。急性和慢性的应激作用于心脏，会导致心电生理活动不稳定，促发心律失常和SCD。既往研究表明，自主神经系统功能失调、心肌缺血是应激导致心电活动不稳定的重要机制，可表现为HRV减小、窦性心律震荡(HRT)等。应激性心肌病(TTC)是急性应激损害心脏结构和功能最经典的案例，其以左心室心尖处心肌变薄呈球状为主要的病理特征，常发生心功能显著下降、致命性室性心律失常、泵衰竭、心脏破裂和血栓形成，85%的病例在症状出现前均有身体或精神上的严重应激性事件发生，如配偶去世、恐惧、吵架、经济困境、急性哮喘发作、手术、化疗、脑卒中等。长期的焦虑、抑郁等情绪作为慢性应激源常常导致HRV下降，增加心律失常的发生风险，与总体死亡率和SCD显著相关。
虽然，应激与心脏电生理活动的关系已被大量的临床和基础研究所证实，但是其具体的分子机制还未明了。我们前期实验提示NMDAR可能在其中发挥了重要的作用，为此，本部分研究通过不可控慢性温和刺激(chronic mild stress，CMS)制作慢性应激动物模型，检测模型大鼠的心电生理的改变，并探讨NMDAR在其中的作用，为进一步研究应激与心律失常的关系提供新的靶点。
一、材料与方法
1. 实验动物 清洁级的Wistar大鼠45只，体重在200~220 g，均购于湖北省疾病预防控制中心，均在温度、湿度恒定，且昼夜交替(12 h)的环境中饲养。在新环境中预饲养3天后，将动物随机均分为3组：对照组(CTL组)、CMS组和CMS+MK-801组(C+M组)。三组动物分别给予0.9%的生理盐水(1 mL/kg)、0.9%的生理盐水(1 mL/kg)和MK-801(特异性NMDAR*制剂抑**，0.5 mg/(mL·kg))，均经腹腔持续注射6周。
2. CMS CMS组和C+M组大鼠均给予如下刺激：鼠笼45 ℃倾斜24 h，潮湿垫料(200 mL水)24 h，限制活动2 h，4 ℃冰水游泳20 min，42 ℃热水游泳10 min，持续禁食24 h，持续禁水24 h，夹尾1 min，24 h持续光照，闪光灯照射24 h。将上述10种刺激随机安排到6周，每日1～2种刺激，同种刺激不连续出现，以使动物不能预料刺激的发生。CTL组在常规的饲养环境中，不给予上述任何刺激。
3. 心脏超声检测 1%的水合氯醛(0.3 mL/kg，Sigma公司)经腹腔注射麻醉大鼠，待大鼠深麻醉后置于37 ℃恒温加热板上固定四肢，将大鼠左胸前区剃毛，涂抹耦合剂，取左侧卧位或仰卧位对大鼠进行超声检查。采用高频超声诊断仪(SONOS 5500，飞利浦电子，阿姆斯特丹)，频率为15MHz，选取标准左心室乳头肌短轴切面，测量大鼠左心室舒张末期直径(left ventricular end-diastolic dimension，LVEDD)、左心室收缩末期直径(left ventricular end-systolic dimension，LVESD)、左心室后壁厚度(left ventricular posterior wall depth，LVPWD)、舒张期室间隔厚度(interventricular septal depth，IVSD)、短轴缩短率(fractional shortening，FS)。每组至少采集10个大鼠的数据。
4. 遥测心电图和HRV分析 大鼠经1%的水合氯醛(0.3 mL/kg，Sigma公司)深麻醉后，置于37 ℃恒温加热板固定四肢。在下腹部右侧钝性分离皮下组织，形成囊袋，将植入子(型号EA-F40，DSI公司)体部置入囊袋，再将阳性和阴性电极按体表Ⅱ导联的标准位置分别固定在右侧肩部和左侧腹股沟皮下。接收器(RMC-1)置入每只动物笼下，并与数据采集体系(Dataquest A.R.T，DSI公司)连接，增益为1000倍，滤波范围为0.05～1 kHz，信号采集频率为1000 Hz。为排除手术、外伤的干扰，在置入的3日后开始记录，每只大鼠连续记录24 h。将记录数据经数模转换后于LabChart 7.0软件(AD公司)上进行离线分析。选取无运动干扰和心律失常的ECG节段，10 min为一段，采用时域和频域法对HRV进行分析，包括SDNN、RMSSD、LF、HF、LF/HF，并分析24 h的心率昼夜变化。
5. 离体电生理研究 大鼠在深麻醉(1%的水合氯醛，0.3 mL/kg)和肝素钠(400 U/只)充分抗凝10 min后，迅速处死，开胸分离心脏，按Langerdorff技术进行离体灌流。灌流压力为70～90cmH2O，温度为37 ℃。灌流液为HEPES缓冲的Tyrode’s液：NaCl，135 mmol/L；KCl，5.4 mmol/L；CaCl2，1.8 mmol/L；MgCl2，1 mmol/L；Na2HPO4，0.3 mmol/L；HEPES，10 mmol/L；葡萄糖，10 mmol/L。用NaOH将pH校正为7.4。每个心脏在进行下一步实验前先预灌流20 min，让其恢复到稳定的状态。排除不能恢复自主节律和发生不可逆性心肌缺血的心脏。
用自制的Ag-AgCl电极(直径：0.25 mm，间距：0.5 mm)记录MAP；将铂金电极(直径：0.25 mm，间距：1 mm)置入作为刺激电极。均以2 ms的方波和2倍舒张期阈值进行起搏刺激，所有信号均由PowerLab系统经0.3 Hz～1 kHz放大和过滤。
(1) ERP：在基线水平记录10 min后，行程控刺激，以8个稳定周长(300 ms)S1刺激，附加一个额外期前刺激(S2)，S2的周长从100 ms开始以1 ms反扫，直至出现心律失常或ERP。分别测量左心房、右心房、左心室前壁基底部(LAB)、左心室后壁基底部(LPB)、左心室前壁心尖部(LAA)、左心室后壁心尖部(LPA)、右心室基底部(RB)、右心室心尖(RAV)的ERP。根据ERP的均值和方差计算心房和心室的ERP变异系数(coefficient of variation，COV)：SD/mean。并记录S1S2刺激后早期后除极(EAD)的个数。
(2) ALT：以动态刺激模式S1S1程序测量ALT和BVR，评价左心室的复极频率适应性。S1S1刺激模式：100个逐步缩小频率的S1刺激左心室前游离壁(LAF)，每组刺激持续15 s以维持稳定状态，相邻两组刺激间隔30 s以消除起搏记忆，如果发生VAs，则阻断5~10 min以维持心电恢复。ALT定义为连续的APD90差值大于5 ms。
(3) 心律失常诱发：以50 Hz的周长持续2 s的Burst刺激程序测量心律失常诱发率，总共刺激3次，如果心律失常未诱发，则重复3次。AF定义为大于2 s的连续紊乱的心房电生理活动，伴有不规则的心室电生理活动。VAs定义为大于2 s的连续快速或紊乱的室性电信号。根据临床标准将2~30 s的VAs定义为非持续性VAs，大于30 s的VAs定义为持续性VAs。
6. 钙浓度和钙瞬变
(1) 心肌细胞分离：采用酶解法制备心肌单个细胞，经深麻醉(1%的水合氯醛，0.3 mL/kg)，肝素钠(400 U/只)充分抗凝10 min后，开胸，迅速剪取心脏，置于预先氧饱和的冰冷生理盐水中，剪去心包及脂肪垫，心脏修饰后固定在Langendorff灌流装置上，将一2F的球囊通过灌流装置下端的三通管放入主动脉瓣水平以下，给予2个大气压的压力使其膨胀，封堵由于前期造模手术形成的主动脉瓣漏口，以防止灌流液回流引起灌注压不足。经主动脉根部逆行用不含牛血清白蛋白的KB液灌流(灌流压70 cmH2O，恒温37.0 ℃)5 min，再用0.4 mg/mL胶原酶Ⅰ与0.1 mg/mL蛋白酶E的低钙(含100 μmol/L Ca2+)台氏液反复灌流10～15 min，至心脏膨大、透明、松弛后改用含0.1 mg/mL牛血清白蛋白的KB液灌流5 min；随后取下心脏，将心房肌和左心室分别剪碎，加入含0.05 mg/mL牛血清白蛋白的KB液5～10 mL，用开口光滑的吸管轻轻吹打，37 ℃下温育5～10 min后用含0.05 mg/mL牛血清白蛋白的KB液稀释4倍，然后用200目的尼龙滤网过滤，得到分离的单个心室肌细胞，分离后的细胞存放于含有0.05 mg/mL牛血清白蛋白的KB液中，室温保存备用，并在8～10 h完成实验，实验前1 h逐步复钙至终钙浓度达到1.0 mmol/L。
(2) 肌质网钙浓度的测定：应用钙荧光染料Fluo-5N-AM孵育细胞，给予不同受体活*药性**物，给予不同频率刺激方案(静息、单次刺激、0.25 Hz、0.5 Hz、1 Hz)后直接测量Fluo-5N-AM与肌质网内游离钙离子结合后的荧光值，可通过公式［Ca2+］SR=Kd(F0—Fmin)/(Fmax—F0)计算出肌质网内游离钙含量；肌质网总钙容量：应用10mmol/L咖啡因灌流10s诱发的钙瞬变(Ca2+transient，CaT)测得Fpeak/F0荧光值，可通过公式［Ca2+］SRT=Kd(F0—Fmin)/(Fpeak—F0)计算出肌质网总钙容量。其中，Kd为Fluo-4-AM的解离常数，为348nM；F为扫描得到的荧光强度值，Fmax、Fmin分别为加10mmol/L咖啡因及5mM EGTA 时测得的荧光强度值。
F0为给予咖啡因之前的全细胞荧光信号，Fpeak为给予咖啡因后全细胞荧光信号的峰值。
(3) 钙瞬变幅值的测定：应用钙荧光染料Fluo-4(10 μmol/L)孵育细胞30 min后，采用线扫描方式和二维扫描方式相结合：给予不同受体活*药性**物后在二维扫描模式下选定细胞感兴趣区域，通过调节细胞对焦平面选取合适的细胞层面。然后将扫描线置于细胞长轴，转换为线扫描方式。二维扫描方案设置如下：单幅二维图像的像素数为128×64，空间分辨率为1.64urn；单图扫描时间为50ms；每次给药后连续扫描20s图像，相邻两幅图像无采样时间间隔。线扫描方案设置如下：像素数为1024，空间分辨率为1.64urn；共扫描1000条线，采样速率为2ms/线。场刺激的刺激频率为1 Hz，所取连续5个瞬变的平均值作为实验数据。钙瞬变的大小以标准荧光强度的变化即F/F0表示，其中F0表示静息状态的荧光强度，所有数值均减去背景荧光。
7. Western Blot 动物在深麻醉后快速处死，取出心脏，分离心房肌和心室肌，经液氮冷冻后，储藏在-80 ℃冰箱中备用。按照第一部分的方法检测心房肌和心室肌的NMDAR1、CaMKⅡ、p CaMKⅡ蛋白的表达量。
二、结果
1. 体重和心功能 在进行6周的CMS后，我们比较了各组大鼠心脏重量和左心室功能的差异。与CTL组相比，CMS组和C+M组动物的体重(body weight，BW)较轻，差异均有统计学意义(P<0.05)；CMS组动物的心脏重量(heart weight，HW)和HW/BW均显著大于CTL组动物，差异有统计学意义(P<0.01)；C+M组与CTL组的HW和HW/BW相近，差异无统计学意义(P>0.05)，见表1-5。超声心动图显示左心室大小(LVEDD和LVESD)和收缩功能(LVEF和FS)在三组间相近，差异均无统计学意义(P>0.05)，见表1-5。
注：BW，body weight，体重；HW，heart weight，心脏重量；LVEDD，left ventricular enddiastolic dimension，左心室舒张末期直径；LVESD，left ventricular endsystolic dimension，左心室收缩末期直径；LVEF，left ventricular ejection fraction，左心室射血分数；FS，fractional shortening，短轴缩短率。与CTL组比较，#P<0.05和*P<0.01。
2. 遥测ECG 持续24 h的遥测ECG记录结果显示，CMS组大鼠频繁出现单个或成对的PVC，而CTL组和C+M组大鼠只有偶发的PVC，个数显著少于CMS组，见图1-15。
图1-15 遥测ECG显示CMS组大鼠发生的室性期前收缩(PVC)图形
图1-16 各组大鼠的RR间期离散度图形
注：与CTL组相比，CMS组的RR间期离散度显著减小。CMS组大鼠的平均HR显著大于CTL组，但是RR间期的离散度却显著小于CTL组，差异均有统计学意义(P<0.01)；C+M组和CTL组相比较，HR和RR离散度相近，差异均无统计学意义(P>0.05)，见图1-16。离线分析HRV显示，与CTL组相比，CMS组大鼠的HRV显著减小；时域分析显示SDNN和RMSSD均显著减小，差异有统计学意义(P<0.01)；频域分析显示，LF增大，HF减小，LF/HF增大，差异均有统计学意义(P<0.01)。而C+M组和CTL组相比，上述HRV参数相近，差异均无统计学意义(P>0.05)，见表1-6。
注：与CTL组比较，*P<0.01。
3. 离体电生理 与CTL组相比，CMS组的心房有效不应期(AERP：(15.5±1.8) ms vs (33.6±5.80) ms，P<0.01)和心室有效不应期(VERP：(41.8±6.0) ms vs (49.2±1.5) ms，P<0.01)较小，而VERP的空间离散度较大(COVVERP：(11.7±2.7)% vs (5.6±1.5)%，P<0.01)；C+M组与CTL组的AERP((31.3±8.7) ms vs (33.6±5.80) ms，P=0.40)、VERP((47.0±4.6) ms vs (49.2±1.5) ms，P=0.27)和COVVERP((6.5±2.8)% vs (5.6±1.5)%，P=0.39)相近，见图1-17。
图1-17 三组大鼠的AERP、VERP及其空间离散度的比较
注：与CTL组比较，*P<0.01。
在S1S1刺激模式下，我们比较了三组大鼠心房和心室电交替(ALT)的阈值。结果显示，与CTL 组相比，CMS组的心房ALT的刺激阈值显著增加(中位数周长：100 ms vs 70 ms，P<0.01)，C+M组的心房ALT阈值与CTL组相比无显著增加(80 ms vs 70 ms，P>0.05)；心室ALT的阈值趋势与心房相同，CMS组的心室ALT阈值显著大于CTL组(140 ms vs 90 ms，P<0.01)，C+M组的心室ALT阈值与CTL组相比无显著增加(100 ms vs 90 ms，P>0.05)，见图1-18和图1-19。
图1-18 S1S1刺激下右心房(RA)的电交替图形
注：与CTL组比较，*P<0.01。
图1-19 S1S1刺激下左心室(LV)的电交替图形
注：与CTL组相比，*P<0.01。
经过6周的慢性应激程序刺激后，心脏在离体状态下给予Burst刺激，均可诱发出AF(12/12，100%)，MK-801干预后显著降低AF的诱发率(2/12，16.7%)，差异有统计学意义(P<0.01)；CMS组的AF持续时间中位数显著大于C+M组(15.3 s vs 4.8 s，P<0.01)，见图1-20。
图1-20 AF易感性比较
注注：(a)CMS组大鼠在Burst刺激下的典型AF图形；(b)与CTL组相比，CMS组AF的诱发率显著增加；(c)与C+M组相比，CMS组AF持续时间显著增加。*P<0.01，与CTL组或C+M组比较。
此外，CMS组大鼠均可诱发出VT(12/12，100%)，MK-801干预后显著降低VT的诱发率(3/12，25%)，差异有统计学意义(P<0.01)；CMS组的持续性VT比例显著高于C+M组(75% vs 0%，P<0.01)，而且CMS组的VT持续时间中位数也显著大于C+M组(57.1 s vs 7.3 s，P<0.01)，见图1-21。
图1-21 VAs易感性比较
注：(a)CMS组大鼠在Burst刺激下典型的持续性VT图形；(b)与CTL组相比，CMS组VT的诱发率显著增加；(c)和(d)，与C+M组相比，CMS组持续性VT比例和VT的持续时间显著增加。*P<0.01，与CTL组或C+M组比较。
4. 自发钙释放 CTL组、CMS组和C+M组分别成功记录了19、20和16个心房肌细胞。与CTL组相比，以0.5 Hz和1 Hz的频率电刺激结束后，CMS组的心房肌细胞自发的Ca2+释放比例均较高：0.5 Hz(15/20 vs 1/19，P<0.01)；1 Hz(20/20 vs 4/19，P<0.01)。而C+M组与CTL组相比，0.5 Hz和1 Hz的频率电刺激结束后的心房肌细胞自发的Ca2+释放比例相近：0.5 Hz(3/16 vs 1/19，P=0.31)；1 Hz(4/16 vs 4/19，P=0.55)，见图1-22。
CTL组、CMS组和C+M组分别成功记录了17、21和18个心室肌细胞。与CTL相比，以0.5Hz和1Hz的频率电刺激结束后，CMS组的心室肌细胞自发的Ca2+释放比例均较高：0.5 Hz(16/21vs2/17，P<0.01)；1 Hz(19/21 vs 3/17，P<0.01)。而C+M组与CTL组相比，0.5Hz和1Hz的频率电刺激结束后的心室肌细胞自发的Ca2+释放比例相近：0.5Hz(4/18vs2/17，P=0.53)；1 Hz(5/18 vs 3/17，P=0.38)，见图1-22。
图1-22 心肌细胞的自发性钙释放图形
注：*P<0.01，与CTL组比较。
5. Western Blot 经过6周的慢性应激程序刺激后，大鼠心房肌和心室肌的NMDAR1表达显著上调，与CTL组相比，差异有统计学意义(P<0.01)；而C+M组和CTL组相比，差异无统计学意义(P>0.05)。与CTL组相比，CMS组心房肌和心室肌的CaMKⅡ总量无显著改变，但pCaMKⅡ的表达量显著上调，差异有统计学意义(P<0.01)；与NMDAR1的趋势相同，C+M组和CTL组的心房肌和心室肌CaMKⅡ和pCaMKⅡ的表达量相近，差异无统计学意义(P>0.05)，见图1-23。
图1-23 心肌NMDAR1、CaMKⅡ和pCaMKⅡ的表达量
注：*P<0.01为与CTL组比较。
三、讨论
本节在前两节的基础上，通过慢性温和刺激(CMS)制作慢性应激动物模型，探讨了NMDAR与应激相关心律失常的关系及其具体机制，进一步拓展了NMDAR在心脏电生理和心律失常中的作用。本研究主要有以下发现：①CMS动物的AF和VF易感性显著增加；②抑制NMDAR能够显著降低CMS动物的心律失常诱发率；③NMDAR上调引起自主神经功能失调、钙运作紊乱，导致心脏电生理活动不稳定，最终使CMS动物发生心律失常。
应激的范围非常广泛，多种自然环境、社会环境、个人身体或情绪的变化都可以归为应激源，小到心理压力，大到地震、海啸、战争等灾难性事件。然而，越来越多的研究发现，上述应激变化常常影响心脏电生理活动，显著增加心律失常和猝死的风险。2011年日本岩手县地震海啸后4周发生的猝死人数大约为往年的两倍，地震急性期内猝死的标准化发病率显著高于往年；同样，早在20年前人们就发现地震时的情绪压力与SCD的关系，1994年洛杉矶大地震当天SCD的人数为24人，显著高于地震前的平均人数(4.6人)，地震6天后才降到平均水平。此外，长期有抑郁、焦虑情绪以及A型性格的人群，发生心血管事件和SCD的风险显著高于一般人群。然而，应激是怎样导致心律失常的，其具体机制还不清楚，有研究提示其与下丘脑垂体轴和肾上腺交感神经系统激活、血清素大量释放等有关，但是研究也发现上述机制并不能完全解释清楚，其他的受体和分子机制也可能在其中发挥重要的作用。
我们前期研究发现，NMDAR可能是应激导致心脏电生理活动紊乱的重要分子靶点。在本研究中，我们深入探讨了NMDAR在其中的作用及其具体机制。首先，我们运用CMS程序制作了慢性应激大鼠模型，CMS是采用不同的温和刺激方式，通过不可控的随机刺激，给予动物长期的应激。该模型在有些实验中心已经制作成熟，经过多次复制，一般给予4周的刺激，基本可以引起活动度下降等应激样行为学改变。本部分实验为了更好地模拟慢性应激，故延长了刺激的周期，给予了6周的刺激。
遥测ECG结果显示，慢性应激6周后，动物频繁发生PVC，呈单个或二联率，显著高于正常对照组动物；然而，在慢性刺激的同时抑制NMDAR，可显著压制PVC的发生。在离体的状态下，给予心脏程序电刺激，显示慢性应激动物的AF和VT的发生率、持续时间均显著增加，与遥测ECG的趋势相同，抑制NMDAR同样可以显著降低CMS动物的AF和VT易感性。上述结果证明，CMS程序成功地模拟了临床上应激与心律失常的关系，为研究提供了合理的动物基础，并且提示NMDAR可能在其中发挥重要的作用。
为了研究具体的机制，本研究从NMDAR的结构和功能特性着手，提出自主神经系统和钙运作紊乱的两个假说。这是由于NMDAR在自主神经系统的各个层面均丰富表达，起着调节自主神经的功能；另外，NMDAR也广泛表达于心房肌和心室肌上，具有受体和通道的双重特性，激活时通道开放，引起Ca2+大量内流，是NMDAR发挥功能的关键步骤。
应激状态常常导致自主神经功能紊乱，主要表现为交感神经活动增强，而副交感神经活动减弱。我们通过分析HRV，发现CMS引起控制心率的交感成分增加，而副交感神经成分减少，使心率明显提高，心率的变异性指标SDNN减小。通过频谱分析，发现LF增大，而HF减小，LF/HF显著增大。而抑制NMDAR基本可以消除CMS引起的上述HRV变化。结果均表明，CMS可使自主神经功能紊乱，心率调节异常，NMDAR抑制后可以显著减少CMS导致的自主神经功能紊乱。HRV是评价自主神经功能的重要指标，通过计算窦房结每搏的变异度来分析自主神经对心血管系统的调节作用，对预测心律失常和SCD具有良好的价值。副交感神经通过释放乙酰胆碱(作用于毒蕈碱型受体)对窦房结发挥独特的快速动态调控作用，此作用反映在HRV的HF成分中；交感神经通过释放去甲肾上腺素(作用于β受体)对窦房结功能起着相对较慢的调控作用，因此反映在HRV的LF成分中。NMDAR受体在中枢和外周的自主神经系统结构中均丰富表达，与自主神经功能关系密切。在下丘脑室旁核上微量注射NMDA激活NMDAR，会引起肾交感神经活动增加、血压升高和心率增快，在心力衰竭(心衰)模型中表现得更为明显，同时伴有下丘脑室旁核NMDAR转录和表达上调。在交感神经增生的心脏模型中NMDAR表达上调，与12 mg/kg的NMDA灌流心肌梗死并交感神经增生的离体心脏，可促发VT和VF。在第二部分，我们也发现，慢性激活NMDAR后显著减低HRV，并增大LF，减小HF，使自主神经活动失衡。自主神经系统的结构和功能均深刻地影响心律失常的发生和维持，而β受体阻滞剂或自主神经消融能够有效地预防和治疗多种心律失常，并能预防SCD，降低心血管死亡率。因此，自主神经功能紊乱可能是NMDAR介导应激性心律失常的重要机制之一。
本研究发现，6周的CMS使心肌细胞的钙运作紊乱，表现为肌质网的钙离子浓度升高，钙瞬变幅值增加，衰减时程延长，并出现自发的钙波和钙释放；抑制NMDAR能够逆转CMS导致的钙运作紊乱。钙离子是触发心脏兴奋收缩耦联(excitationcontraction coupling，ECC)的关键离子，心脏具有精细的钙调控系统，主要涉及三大过程：钙离子进入胞质、移出胞质和再摄取。由电压门控的L型钙通道进入胞内的少量钙离子介导的肌质网钙库大量释放钙离子进入胞质，完成了一次钙离子介导的钙释放(Ca2+ induced Ca2+ Release，CICR)过程，引起心肌细胞收缩；此后的舒张期，胞质内大部分钙离子经钙泵重摄取进入肌质网内，剩余的钙离子经细胞膜上的钠钙交换体转运至胞外。钙瞬变是全细胞水平游离钙离子浓度发生快速增高和缓慢恢复的动态变化过程，反映了钙库释放和重摄取功能和整体细胞的游离钙离子浓度。钙瞬变的幅度反映了细胞膜上L型钙通道和肌质网膜上RyR受体操纵的钙通道的活性，而钙瞬变的时程则主要反映了肌质网钙泵的活性，其改变往往与钙离子浓度的改变呈正相关。钙运作过程也与心脏电生理活动紧密相关，是心电生理的重要基础。钙离子作为心肌细胞复极过程的关键阳性离子，生理状态下参与平台期的形成过程。当心肌细胞胞质内钙离子超负荷，将会引起钙运作相关细胞器内的钙离子浓度增加，如线粒体、肌质网等。钙离子是重要的第二信使，大量的钙离子会启动下游的信号通路，引起对应的靶蛋白的修饰和表达改变，最终导致相关的生物学改变。在心脏中，CaMKⅡ是钙离子结合的主要蛋白酶，当钙离子浓度增加时，CaMKⅡ磷酸化，可导致钙运作相关蛋白发生改变，如RYR2、CaL、ATPca和PLB，最终引起细胞内钙运作失去平衡，发生钙运作紊乱。另外，心肌细胞上的Na+通道和K+通道也是pCaMKⅡ的靶点，Na+通道和K+通道的表达、转运、定位将受到影响。钙运作紊乱和离子通道改变均会使正常的心电生理活动紊乱，最终引起心律失常。
NMDAR是钙离子高电导的受体，钙离子也是NMDAR发挥生物学作用的基础。研究表明，随着NMDA的浓度增加，心肌细胞内的钙离子浓度也会显著增加，并会最终导致心肌细胞线粒体发生氧化应激，启动凋亡过程。本研究发现，CMS使心肌细胞的肌质网内的钙离子浓度增加，钙运作紊乱，出现了逐波交替的钙瞬变过程，并引起自发的钙离子释放。自发的钙离子释放到达除极阈值时引起一次自发的动作电位，该过程称为后除极，是导致心律失常的重要机制之一。与之相对的是，CMS动物的PVC、AF和VT发生率均显著增加。然而，NMDAR的阻滞剂抑制了上述过程，未出现明显的钙运作紊乱，提示NMDAR可能是重要的调控靶点。
综上所述，本节研究证实了慢性应激将增加心律失常的发生风险，并验证了NMDAR可能通过自主神经活动和钙运作这两个主要途径，参与了应激引起心电生理活动异常的过程，为防治应激性心律失常提供了新的靶点和思路。
参考文献
［1］Marsman R F，Tan H L，Bezzina C R.Genetics of sudden cardiac death caused by ventricular arrhythmias［J］.Nature reviews cardiology，2014，11(2)：96-111.
［2］John R M，Tedrow U B，Koplan B A，et al.Ventricular arrhythmias and sudden cardiac death［J］.Lancet，2012，380(9852)：1520-1529.
［3］Gill S，Veinot J，Kavanagh M，et al.Human heart glutamate receptors implications for toxicology，food safety，and drug discovery［J］.Toxicol Pathol，2007，35(3)：411-417.
［4］Lü J，Gao X，Gu J，et al.Nerve sprouting contributes to increased severity of ventricular tachyarrhythmias by upregulating iGluRs in rats with healed myocardial necrotic injury［J］.J Mol Neurosci，2012，48(2)：448-455.
［5］D’Amico M，Di Filippo C，Rossi F，et al.Arrhythmias induced by myocardial ischaemiareperfusion are sensitive to ionotropic excitatory amino acid receptor antagonists［J］.Eur J Pharmacol，1999，366(2-3)：167-174.
［6］Matsuoka N，Kodama H，Arakawa H，et al.N-Methyl-D-aspartate receptor blockade by dizocilpine prevents stress-induced sudden death in cardiomyopathic hamsters［J］.Brain Res，2002，944(1-2)：200-204.
［7］Flores-Soto M E，Chaparro-Huerta V，Escoto-Delgadillo M，et al.Structure and function of NMDA-type glutamate receptor subunits［J］.Neurologia，2012，27(5)：301-310.
［8］Gao X，Xu X，Pang J，et al.NMDA receptor activation induces mitochondrial dysfunction，oxidative stress and apoptosis in cultured neonatal rat cardiomyocytes ［J］.Physiol Res，2007，56(5)：559-569.
［9］Qu Z，Nivala M，Weiss J N.Calcium alternans in cardiac myocytes：order from disorder ［J］.J Mol Cell Cardiol，2013，58：100-109.
［10］Izu L T，Xie Y，Sato D，et al.Ca2+ waves in the heart［J］.J Mol Cell Cardiol，2013，58：118-124.
［11］Weiss J N，Karma A，Shiferaw Y，et al.From pulsus to pulseless：the saga of cardiac alternans［J］.Circ Res，2006，98(10)：1244-1253.
［12］Floré V，Willems R.T-wave alternans and beat-to-beat variability of repolarization：pathophysiological backgrounds and clinical relevance［J］.Acta Cardiol，2012，67(6)：713-718.
［13］Wilson L D，Rosenbaum D S.Mechanisms of arrythmogenic cardiac alternans［J］.Europace，2007，9 (Suppl 6)：77-82.
［14］Birnbaum S G，Varga A W，Yuan L L，et al.Structure and function of Kv4-family transient potassium channels［J］.Physiol Rev，2004，84(3)：803-833.
［15］Maoz A，Krogh-Madsen T，Christini D J.Instability in action potential morphology underlies phase 2 reentry：a mathematical modeling study［J］.Heart Rhythm，2009，6(6)：813-822.
［16］Vandenberg J I，Perry M D，Perrin M J，et al.hERG K(+)channels：structure，function，and clinical significance［J］.Physiol Rev，2012，92(3)：1393-1478.
［17］Merchant F M，Armoundas A A.Role of substrate and triggers in the genesis of cardiac alternans，from the myocyte to the whole heart：implications for therapy［J］.Circulation，2012，125(3)：539-549.
［18］Pueyo E，Husti Z，Hornyik T，et al.Mechanisms of ventricular rate adaptation as a predictor of arrhythmic risk［J］.Am J Physiol Heart Circ Physiol，2010，298(5)：H1577-1587.
［19］Sipido K R.Calcium overload，spontaneous calcium release，and ventricular arrhythmias ［J］.Heart Rhythm，2006，3(8)：977-979.
［20］Vacek T P，Vacek J C，Tyagi S C.Mitochondrial mitophagic mechanisms of myocardial matrix metabolism and remodelling［J］.Arch Physiol Biochem，2012，118(1)：31-42.
［21］Takai H，Katayama K，Yasoshima A，et al.NMDA-induced apoptosis in the developing rat brain ［J］.Exp Toxicol Pathol，2003，55(1)：33-37.
［22］Tyagi N，Vacek J C，Givvimani S，et al.Cardiac specific deletion of N-methyl-d-aspartate receptor 1 ameliorates mtMMP-9 mediated autophagy/mitophagy in hyperhomocysteinemia［J］.J Recept Signal Transduct Res，2010，30(2)：78-87.
［23］Leung J C，Travis B R，Verlander J W，et al.Expression and developmental regulation of the NMDA receptor subunits in the kidney and cardiovascular system［J］.Am J Physiol Regul Integr Comp Physiol，2002，283(4)：R964-971.
［24］Ferreira-Junior N C，Fedoce A G，Alves F H，et al.Medial prefrontal cortex N-methyl-D-aspartate receptor/nitric oxide/cyclic guanosine monophosphate pathway modulates both tachycardic and bradycardic baroreflex responses［J］.J Neurosci Res，2013，91(10)：1338-1348.
［25］Chapp A D，Gui L，Huber M J，et al.Sympathoexcitation and pressor responses induced by ethanol in the central nucleus of amygdala involves activation of NMDA receptors in rats［J］.Am J Physiol Heart Circ Physiol，2014，307(5)：H701-709.
［26］Barutcu A，Temiz A，Bekler A，et al.Arrhythmia risk assessment using heart rate variability parameters in patients with frequent ventricular ectopic beats without structural heart disease［J］.Pacing Clin Electrophysiol，2014，37(11)：1448-1454.
［27］La Rovere M T，Pinna G D，Maestri R，et al.Short-term heart rate variability strongly predicts sudden cardiac death in chronic heart failure patients ［J］.Circulation，2003，107(4)：565-570.
［28］Lombardi F，Mkikallio T H，Myerburg R J，et al.Sudden cardiac death：role of heart rate variability to identify patients at risk［J］.Cardiovasc Res，2001，50(2)：210-217.
［29］Xhyheri B，Manfrini O，Mazzolini M，et al.Heart rate variability today［J］.Prog Cardiovasc Dis，2012，55(3)：321-331.
［30］Shaffer F，McCraty R，Zerr C L.A healthy heart is not a metronome：an integrative review of the heart’s anatomy and heart rate variability ［J］.Front Psychol，2014，5：1040.
［31］Mkikallio T H，Barthel P，Schneider R，et al.Prediction of sudden cardiac death after acute myocardial infarction：role of Holter monitoring in the modern treatment era［J］.Eur Heart J，2005，26(8)：762-769.
［32］Huikuri H V，Raatikainen M J，MoerchJoergensen R，et al.Prediction of fatal or nearfatal cardiac arrhythmia events in patients with depressed left ventricular function after an acute myocardial infarction ［J］.Eur Heart J，2009，30(6)：689-698.
［33］Barutcu A，Temiz A，Bekler A，et al.Arrhythmia risk assessment using heart rate variability parameters in patients with frequent ventricular ectopic beats without structural heart disease［J］.Pacing Clin Electrophysiol，2014，37(11)：1448-1454.
［34］Shi S，Liu T，Li Y，et al.Chronic N-methyl-D-aspartate receptor activation induces cardiac electrical remodeling and increases susceptibility to ventricular arrhythmias［J］.Pacing Clin Electrophysiol，2014，37(10)：1367-1377.
［35］Matsuo I，Hirooka Y，Hironaga K，et al.Glutamate release via NO production evoked by NMDA in the NTS enhances hypotension and bradycardia in vivo［J］.Am J Physiol Regul Integr Comp Physiol，2001，280(5)：R1285-1291.
［36］Chapp A D，Gui L，Huber M J，et al.Sympathoexcitation and pressor responses induced by ethanol in the central nucleus of amygdala involves activation of NMDA receptors in rats［J］.Am J Physiol Heart Circ Physiol，2014，307(5)：H701-H709.
［37］Krummen D E，Bayer J D，Ho J，et al.Mechanisms of human atrial fibrillation initiation：clinical and computational studies of repolarization restitution and activation latency［J］.Circ Arrhythm Electrophysiol，2012，5(6)：1149-1159.
［38］Narayan S M，Kazi D，Krummen D E，et al.Repolarization and activation restitution near human pulmonary veins and atrial fibrillation initiation：a mechanism for the initiation of atrial fibrillation by premature beats［J］.J Am Coll Cardiol，2008，52(15)：1222-1230.
［39］Hashimoto N，Yamashita T，Tsuruzoe N.Tertiapin，a selective IKACh blocker，terminates atrial fibrillation with selective atrial effective refractory period prolongation ［J］.Pharmacol Res，2006，54(2)：136-141.
［40］Hashimoto N，Yamashita T，Fujikura N，et al.NIP-141，a multiple ion channel blocker，terminates aconitineinduced atrial fibrillation and prevents the rapid pacinginduced atrial effective refractory period shortening in dogs ［J］.Europace，2007，9(4)：246-251.
［41］Yue L，Xie J，Nattel S.Molecular determinants of cardiac fibroblast electrical function and therapeutic implications for atrial fibrillation ［J］.Cardiovasc Res，2011，89(4)：744-753.
［42］Akoum N，Daccarett M，Mcgann C，et al.Atrial fibrosis helps select the appropriate patient and strategy in catheter ablation of atrial fibrillation：a DEMRI guided approach ［J］.J Cardiovasc Electrophysiol，2011，22(1)：16-22.
［43］Gemel J，Levy A E，Simon A R，et al.Connexin40 abnormalities and atrial fibrillation in the human heart ［J］.J Mol Cell Cardiol，2014，76：159-168.
［44］Desplantez T，Dupont E，Severs N J，et al.Gap junction channels and cardiac impulse propagation［J］.J Membr Biol，2007，218(1-3)：13-28.
［45］Gemel J，Simon A R，Patel D，et al.Degradation of a connexin40 mutant linked to atrial fibrillation is accelerated［J］.J Mol Cell Cardiol，2014，74：330-339.
［46］Sipido K R.Calcium overload，spontaneous calcium release，and ventricular arrhythmias ［J］.Heart Rhythm，2006，3(8)：977-979.
［47］Heijman J，Voigt N，Wehrens X H，et al.Calcium dysregulation in atrial fibrillation：the role of CaMKⅡ［J］.Front Pharmacol，2014，5：30.
［48］Leor J，Poole W K，Kloner R A.Sudden cardiac death triggered by an earthquake ［J］.N Engl J Med，1996，334(7)：413-419.
［49］Niiyama M，Tanaka F，Nakajima S，et al.Population-based incidence of sudden cardiac and unexpected death before and after the 2011 earthquake and tsunami in Iwate，northeast Japan［J］.J Am Heart Assoc，2014，3(3)：e798.
［50］Lampert R.Anger and ventricular arrhythmias［J］.Curr Opin Cardiol，2010，25(1)：46-52.
［51］Dimsdale J E.Psychological stress and cardiovascular disease［J］.J Am Coll Cardiol，2008，51(13)：1237-1246.
［52］Yoshikawa T.Takotsubo cardiomyopathy，a new concept of cardiomyopathy：clinical features and pathophysiology［J］.Int J Cardiol，2014，182：297-303.
［53］Eshtehardi P，Koestner S C，Adorjan P，et al.Transient apical ballooning syndrome-clinical characteristics，ballooning pattern，and long-term follow-up in a Swiss population［J］.Int J Cardiol，2009，135(3)：370-375.
［54］石少波，杨波，梁锦军.抑郁症与室性心律失常［J］.中国心脏起搏与心电生理杂志，2012，26(5)：386-388.
［55］Lampert R，Shusterman V，Burg M，et al.Anger-induced T-wave alternans predicts future ventricular arrhythmias in patients with implantable cardioverter-defibrillators［J］.J Am Coll Cardiol，2009，53(9)：774-778.
［56］Mellor G，Raju H，de Noronha S V，et al.Clinical characteristics and circumstances of death in the sudden arrhythmic death syndrome［J］.Circ Arrhythm Electrophysiol，2014，7(6)：1078-1083.
［57］Whang W，Kubzansky L D，Kawachi I，et al.Depression and risk of sudden cardiac death and coronary heart disease in women： results from the Nurses’ Health Study［J］.J Am Coll Cardiol，2009，53(11)：950-958.
［58］Watkins L L，Blumenthal J A，Davidson J R，et al.Phobic anxiety，depression，and risk of ventricular arrhythmias in patients with coronary heart disease［J］.Psychosom Med，2006，68(5)：651-656.
［59］Neelakantan S.Psychology：Mind over myocardium［J］.Nature，2013，493(7434)：S16-17.
［60］Taggart P，Boyett M R，Logantha S，et al.Anger，emotion，and arrhythmias：from brain to heart［J］.Front Physiol，2011，2：67.
［61］石少波，梁锦军，谌晶晶，等.NMDA受体在心肌梗死后抑郁大鼠心电生理异常中的作用［J］.中华心律失常学杂志，2013，17(4)：298-302.
［62］袁晓冉，石少波，王芳，等.舍曲林对心梗后抑郁大鼠行为学及海马NR1表达的影响［J］.武汉大学学报(医学版)，2014,35(1)：56-59.
［63］Tye K M，Mirzabekov J J，Warden M R，et al.Dopamine neurons modulate neural encoding and expression of depression-related behaviour［J］.Nature，2013，493(7433)：537-541.
［64］Shi S，Liang J，Liu T，et al.Depression increases sympathetic activity and exacerbates myocardial remodeling after myocardial infarction：evidence from an animal experiment［J］.PLoS One，2014，9(7)：e101734.
［65］Liang Jinjun,SHI Shao-bo,SHEN Jing-jing,et al.Influence of wenxin particle on cardiac electrophysiology in depressed rats after myocardial infarction［J］.心血管康复医学杂志，2012,21(6)：649-654.
［66］Nazif T M，Vazquez J，Honig L S，et al.Anti-N-methyl-D-aspartate receptor encephalitis：an emerging cause of centrally mediated sinus node dysfunction［J］.Europace，2012，14(8)：1188-1194.
［67］Kishore R K，Abhishekh H A，Udupa K，et al.Evaluation of the influence of ayurvedic formulation(Ayushman-15)on psychopathology，heart rate variability and stress hormonal level in major depression(Vishada)［J］.Asian J Psychiatr，2014，12：100-107.
［68］Patron E，Messerotti B S，Favretto G，et al.Depression is associated with increased vagal withdrawal during unpleasant emotional imagery after cardiac surgery［J］.Auton Neurosci，2015.
［69］Heart rate variability：standards of measurement，physiological interpretation and clinical use.Task Force of the European Society of Cardiology and the North American Society of Pacing and Electrophysiology ［J］.Circulation，1996，93(5)：1043-1065.
［70］Fishman G I，Chugh S S，Dimarco J P，et al.Sudden cardiac death prediction and prevention：report from a national heart，lung，and blood institute and heart rhythm society workshop［J］.Circulation，2010，122(22)：2335-2348.
［71］Verrier R L，Tan A.Heart rate，autonomic markers，and cardiac mortality［J］.Heart Rhythm，2009，6(11 Suppl)：S68-75.
［72］Li Y F，Cornish K G，Patel K P.Alteration of NMDA NR1 receptors within the paraventricular nucleus of hypothalamus in rats with heart failure［J］.Circ Res，2003，93(10)：990-997.
［73］Stern J E，Potapenko E S.Enhanced NMDA receptormediated intracellular calcium signaling in magnocellular neurosecretory neurons in heart failure rats［J］.Am J Physiol Regul Integr Comp Physiol，2013，305(4)：R4144-22.
［74］张树龙.自主神经与心律失常［J］.江苏实用心电学杂志，2012，21(6)：389-407.
［75］Bradfield J S，Vaseghi M，Shivkumar K.Renal denervation for refractory ventricular arrhythmias［J］.Trends Cardiovasc Med，2014，24(5)：206-213.
［76］Chen P S，Chen L S，Fishbein M C，et al.Role of the autonomic nervous system in atrial fibrillation：pathophysiology and therapy［J］.Circ Res，2014，114(9)：1500-1515.
［77］Shen M J，Zipes D P.Role of the autonomic nervous system in modulating cardiac arrhythmias［J］.Circ Res，2014，114(6)：1004-1021.
［78］Walker M A，Williams G S B，Kohl T，et al.Superresolution modeling of calcium release in the heart［J］.Biophys J，2014，107(12)：3018-3029.
［79］Krishna A，Sun L，Valderrábano M，et al.Modeling CICR in rat ventricular myocytes：voltage clamp studies［J］.Theor Biol Med Model，2010，7：43.
［80］Hammer K P，Hohendanner F，Blatter L A，et al.Variations in local calcium signaling in adjacent cardiac myocytes of the intact mouse heart detected with twodimensional confocal microscopy［J］.Front Physiol，2014，5：517.
［81］Nivala M，Ko C Y，Nivala M，et al.Criticality in intracellular calcium signaling in cardiac myocytes［J］.Biophys J，2012，102(11)：2433-2442.
［82］Qu Z，Nivala M，Weiss J N.Calcium alternans in cardiac myocytes：order from disorder［J］.J Mol Cell Cardiol，2013，58：100-109.
［83］Fischer T H，Neef S，Maier L S.The Ca-calmodulin dependent kinase Ⅱ：a promising target for future antiarrhythmic therapies?［J］.J Mol Cell Cardiol，2013，58：182-187.
［84］van Oort R J，McCauley M D，Dixit S S，et al.Ryanodine receptor phosphorylation by calcium/calmodulindependent protein kinase Ⅱ promotes life-threatening ventricular arrhythmias in mice with heart failure［J］.Circulation，2010，122(25)：2669-2679.
［85］Wagner S，Hacker E，Grandi E，et al.Ca/calmodulin kinase Ⅱ differentially modulates potassium currents［J］.Circ Arrhythm Electrophysiol，2009，2(3)：285-294.
［86］Gao X，Xu X，Pang J，et al.NMDA receptor activation induces mitochondrial dysfunction，oxidative stress and apoptosis in cultured neonatal rat cardiomyocytes［J］.Physiol Res，2007，56(5)：559-569.