第八章 半夏曲发酵技术
第八章 半夏曲发酵技术
一、古今文献研究
（一）文献查阅
1.半夏曲的本草考证
半夏曲的炮制及临床应用历史悠久，其本草源流考释如下：
（1）宋代：宋代始有生姜和半夏末制曲法。《太平惠民和剂局方》中有记载“半夏洗七次，姜汁捣作曲”，或“半夏洗为末，姜汁作曲”，又或“半夏汤洗七次为末，生姜汁捣和作曲”；钱乙的《小儿药证直诀》中记载“半夏用生姜三钱同捣成曲，焙干”；《女科百问》中记载“缓息丹……半夏汤洗七次，研成末，姜汁和，候干再为末，啜之，不辣为度”。邵家德本草考证结果表明，半夏曲源自宋代或以前，并非《中药大辞典》称始创于明代的《韩氏医通》和《中医大辞典》中称出自《本草纲目》。
（2）元代：王好古《医垒元戎》中记载：“若产后虚劳日久而脉浮疾，宜柴胡四物汤：柴胡、川芎、当归、熟地黄、芍药……半夏曲，水煎服。”
（3）明清：至明朝，半夏曲不再由半夏末和生姜制曲，而是依据疾病的需求进行化裁，配伍不同的药物造曲，如韩懋的《韩氏医通》卷下记载：“痰分之病，半夏为主。……然必造而为曲，以生姜自然汁、生白矾汤等分共和造曲，楮叶包裹，风干，然后入药。风痰，以猪牙皂角煮汁去渣，炼膏如饧，入姜汁。火痰……以竹沥或荆沥入姜汁。湿痰……以老姜煎浓汤，加煅白矾三分之一……予又以霞天膏加白芥子三分之二，姜汁、矾汤、竹沥造曲，治痰积沉痼者，自能使腐败，随大小便出，或散而为疮，此半夏曲之妙也。”陈嘉谟的《本草蒙筌》卷三中记载：“半夏生嚼戟喉……若研末掺少许枯矾，拌姜汁捏作小饼，风际阴干，此又名半夏曲也。”李时珍的《本草纲目》第十七卷中记载：“今治半夏，惟洗去皮垢，以汤泡浸七日……或研末以姜汁、白矾汤和作饼……待生黄衣，日干用，谓之半夏曲。”稻生宣义的《炮炙全书》卷二中记载：“以半夏洗净，研细，以姜汁矾汤和作饼，楮叶包裹，去叶，晒干用。”陈士铎的《本草新编》卷三中记载：“半夏……研末，每一两，用入枯矾二钱、姜汁一合，捏饼，又名半夏曲也。”此外，在《本草从新》《本草求真》《本草新编》等明清本草著作中，均基本沿袭了《韩氏医通》和《本草纲目》中的炮制方法。
（4）现代：半夏为天南星科植物半夏Pinellia ternate（Thunb.）Breit的干燥块茎，具有燥湿化痰、降逆止呕、消痞散结的功效。半夏生品有毒，对口腔、喉头和消化道黏膜有强烈的刺激性，可导致失音、呕吐、水泻等副作用，严重的喉头水肿可致呼吸困难、窒息等症状，甚至引起死亡。目前对半夏刺激性成分的研究比较多，最早研究认为半夏的刺激性成分是尿黑酸（homengenstic acid），也有专家提出是草酸钙，现代认为具有特殊晶型（细长坚韧，末端尖锐）的草酸钙针晶是半夏的主要刺激性成分。半夏中的草酸钙针晶是由草酸钙和蛋白组成的特殊晶体，正是其特殊的晶型和组成才使得其具有刺激性，半夏中的凝集素蛋白可以增强针晶引起的刺激性。
《中药炮炙经验集成》中收载了半夏曲的现代炮制经验，其发酵处方有漂半夏、姜半夏加生姜和面粉，半夏、法半夏或姜半夏加面粉，法半夏加杏仁、红小豆、麻叶、蓼子、面粉，法半夏加甘草等；炮制工艺有发酵与不发酵以及麸炒和蜜麸炒等。各地发酵处方和炮制工艺各异，究其原因，可能是由于各地按其继承的传统方法演变而来。此外，《全国中药炮制规范》（1988年版）将半夏曲收载于“半夏”项下，《中药大辞典》把“半夏曲”作为品种单列，而在部颁标准第十册则把半夏曲作为中药成方制剂收载，半夏曲的归类、处方和参照标准不能统一。通过市场调研发现，市售半夏曲的处方分别源自部颁标准和《全国中药炮制规范》（1988年版），其中以部颁标准中的半夏曲为主流产品，且只有按部颁标准生产的半夏曲才具有生产批文和质量标准。
2.半夏曲的相关批文和专利
（1）现有批文情况：依据CFDA数据库查询有关半夏曲的生产批文，结果显示，现有批文中的半夏曲是以曲剂进行生产批准文号管理。其次，半夏曲的生产厂家主要位于四川，这反映四川省是曲类生产大省。
（2）相关专利检索及分析：通过对半夏曲发酵相关专利信息进行检索，共有发明专利2项，其中“半夏曲的炮制方法”专利中有关原料的预处理以及发酵工艺参数对我们模拟和研究半夏曲的自然发酵工艺有启示。
（二）调查研究
1.市售半夏曲的产品概况
目前，市场上半夏曲的规格有50g/袋、250g/袋、500g/袋；样品形态有小块状和颗粒（粉末）状；因半夏存在伪品冒充问题，半夏曲当中也存在掺伪品，其价格和成品性状存在很大差异；因半夏曲存在“同名异方”，且由于地方用药习惯不同或参照标准不同，市场上存在不同处方的半夏曲及其炮制品。
2.生产工艺及质量现状调研
目前半夏曲的生产工艺及处方是以部颁标准为主，生产方式为自然发酵，其质量标准也一直沿用1995年的部颁标准，生产工艺参数不明确，质量标准偏低，产品质量不稳定，易导致伪品横行、市场监管难等现象。
近年来，国家政策对中药饮片的部分品种逐渐淡化生产批准文号管理，比如半夏曲、六神曲等产品已不再要求具备批准文号进行生产，只需要具有满足相关生产的要求即可，这既是一个机遇，也是一大挑战。因此，有必要加强对中药发酵类饮片的研究，传承和创新中药的发酵技术，规范发酵工艺，提升标准，保证产品质量。
二、原料与样品采集
1.原料半夏的掺伪研究
鉴于半夏容易与虎掌南星混淆，课题组建立了“半夏药材中水麦冬酸成分检查项补充检验方法”。
2.生产企业调研和样品收集
为了了解半夏曲的生产、销售和质量情况，我们进行了生产企业调研和市售样品收集。资料显示，生产半夏曲的厂家有12家，绝大部分集中在四川省，其中6家有批文、3家仅拥有饮片GMP资质、1家没有任何资质、2家有药品批文但实际并不生产。
在产品调研过程中，课题组收集到5个厂家的12批样品，其中10批生品，2批炒制品。调研发现，半夏曲的生产主要还是采用传统自然发酵，制曲时受杂菌干扰大，生产周期长，受季节影响大，还没有实现产业化和自动化，发酵成品的微生物杂菌数量多，存在较大的安全隐患，亦有直接混匀压块成型（不发酵）的现象。
3.半夏曲原料考证和采购
课题组通过对半夏曲有关国家及地方标准的整理和实际调研发现，半夏曲的主要原料为半夏（清半夏为主）。依托四川新荷花中药饮片股份有限公司自有的GAP基地和半夏饮片生产线，共收集清半夏原料10批，经鉴定和检验均符合药典要求。
三、发酵菌种（群）筛选研究
本课题研究了半夏曲炮制过程中的优势微生物及其在炮制中的作用，为揭示半夏曲炮制机理、规范炮制工艺奠定基础。
（一）主要研究方法
1.应用传统微生物学方法对半夏曲发酵炮制至0h、30h、60h、90h、120h这5个不同时间点样品中的微生物进行培养、菌落计数，尽可能多地挑出不同的菌落，取形态相似且出现频率高的菌落作为优势菌种进行纯化并保存。
2.应用16S rRNA和26S rRNA基因序列分析，对上述分离纯化的优势微生物进行菌种鉴定。
3.应用荧光定量PCR技术对样品中的优势微生物枯草芽孢杆菌、宛氏拟青霉菌、丝衣霉菌、黑曲霉菌进行绝对定量，分析比较半夏曲炮制过程中不同时间点的样品中这四种优势菌的数量变化。
4.对优势微生物枯草芽孢杆菌、宛氏拟青霉菌、丝衣霉菌、黑曲霉菌的生理特性、产酶能力、产黄色素能力进行测定。初步研究这四种优势菌株在半夏曲炮制中的作用。
（二）主要实验结果
1.从5个不同发酵时间点的样品*共中**分离出27株优势菌株，其中包括11株细菌、9株酵母菌、7株霉菌。通过分子生物学鉴定分别为Streptomyces sp.（链霉属）、Staphylococcus epidermidis（表皮葡萄球菌）、Bacillus pumilus（短小芽孢杆菌）、Bacillus sp.（芽孢杆菌属）、Bacillus subtilis（枯草芽孢杆菌）、Bacillus aryabhattai（阿氏芽孢杆菌）、Meyerozyma guilliermondii（季也蒙毕赤酵母菌）、Paecilomyces variotii （宛氏拟青霉菌）、Byssochlamys spectabilis（丝衣霉菌）、Aspergillus niger（黑曲霉菌）。
2.成功构建了枯草芽孢杆菌、宛氏拟青霉菌、丝衣霉菌、黑曲霉菌的荧光定量PCR检测体系，最低检测限度分别为5.84×102copies/μL、6.22×102copies/μL、2.72×10-1copies/μL、5×102copies/μL。5个不同发酵时间点的样品中枯草芽孢杆菌的拷贝数为5.89×103copies/μL、1.26×103copies/μL、2.63×103copies/μL、3.16×104copies/μL、3.09×104copies/μL。发酵0h、30h、60h样品中未检测出宛氏拟青霉，发酵90h、120h的样品中宛氏拟青霉的拷贝数为5.75×105copies/μL、6.92×106copies/μL。发酵0h、30h、60h样品中未检测出丝衣霉菌，发酵90h、120h的样品中丝衣霉菌的拷贝数为1.74×106copies/μL、3.8×106copies/μL。发酵0h、30h样品中未检测出黑曲霉，发酵60h、90h、120h的样品中黑曲霉的拷贝数为1.58×104、2.45×104、1.26×105copies/μL。
3.生理生化特性测试表明，枯草芽孢杆菌液体培养的最适宜温度为35℃，最适pH值为7.0；宛氏拟青霉的最适宜培养温度为29℃，最适pH为7.0；丝衣霉菌的最适宜培养温度为29℃，最适pH为7.5；黑曲霉的最适宜培养温度为37℃，最适pH为7.0。枯草芽孢杆菌、宛氏拟青霉、丝衣霉菌、黑曲霉这四种优势菌株都具有产淀粉酶和产蛋白酶能力。通过初筛只有宛氏拟青霉、丝衣霉菌在平皿培养中显现黄色，测定其色价分别为4.3、3.6U/mL。5个发酵时间点样品中黄色素的含量分别为0.559、0.559、0.574、0.956、1.103μg/mL。
（三）结论
1.首次对半夏曲中的优势微生物进行了分离鉴定。初步研究表明优势微生物在生长过程中产生大量的初生及次生代谢物，比如淀粉酶、蛋白酶等，从而使得经发酵炮制后半夏曲增加了消食健胃的功效。
2.成功建立了半夏曲炮制中优势微生物枯草芽孢杆菌、宛氏拟青霉、丝衣霉菌、黑曲霉的荧光定量PCR检测体系。
3.筛选出两株具有产黄色素能力的菌株，并对半夏曲中黄色素的含量进行了测定。初步表明半夏曲炮制中“黄衣”的形成可能与微生物代谢产生的黄色素有关。
四、工艺优化研究
（一）发酵处方研究
半夏炮制后可以缓和半夏的毒性并增加消食健脾的药效，目前对半夏发酵制曲后减毒增效的研究报道很少，所以本课题采用单次给药毒性实验、家兔眼结膜刺激性实验、小鼠*水氨**诱咳实验、大鼠排痰实验和小鼠胃肠运动实验对不同处方半夏曲发酵后的毒性、刺激性和药效变化进行研究，为半夏曲处方选择提供理论依据。
急毒实验中生半夏、清半夏、处方一、处方二和处方三半夏曲最小致死量（MLD）分为31.46、30.83、17.48、18.02和18.72g/（kg·d），分别相当于临床人用量的174.48、171.33、97.11、100.11和104.00倍，说明生半夏及半夏炮制品在正常的临床用药范围内都是低毒的，安全的。家兔眼结膜刺激实验中，生半夏可引起家兔眼结膜红肿并伴有分泌物排出，按评分结果算生半夏表现为中度刺激性，炮制后的半夏较生半夏对家兔眼结膜的刺激性明显减弱，表现为无刺激性或轻度刺激，表明炮制后可以缓解生半夏的刺激性毒性。以上实验都能说明半夏炮制后可以缓和生半夏的毒性和刺激性，但是不同的炮制品毒性和刺激性的缓和度有所区别。在家兔眼结膜刺激性实验中刺激性的缓和强弱顺序为清半夏组=处方二组＞处方一组＞处方三组＞生半夏组，实验结果说明清半夏和处方二缓和刺激性毒性的效果更好一些。
对小鼠*水氨**诱咳实验、大鼠排痰实验和小鼠胃肠运动实验结果分析，不同处方发酵的半夏曲都有止咳化痰和消食化积的功效，但是按照不同处方发酵的样品药效强度有所区别。对小鼠咳嗽潜伏期的影响顺序为：氢溴酸右美沙芬组＞处方一组＞处方三组＞处方二组＞模型组；对小鼠咳嗽次数的影响顺序为：模型组＞处方二组＞处方三组＞处方一组＞氢溴酸右美沙芬组；大鼠排痰量顺序为：羧甲司坦组＞处方三组＞处方一组＞处方二组＞空白组；小鼠肠推进率顺序为：健胃消食片组＞处方一组＞处方二组＞处方三组＞空白组；小鼠胃排空率顺序为健胃消食片组＞处方一组＞处方二组＞处方三组＞空白组。综合分析以上3个实验，处方三的止咳化痰药效优于其他两个处方，处方一的消食化积药效强于其他两个处方。
清半夏是生半夏用白矾水泡后的炮制品，说明白矾水炮制可以缓和半夏的刺激性，文献研究也发现清半夏的刺激性较生半夏显著降低。处方一和处方二的缓和刺激性效果都要比处方三的半夏曲好，处方三与其他两个处方的区别就是处方三用的是生半夏，另外两个处方用的是清半夏，表明用白矾炮制后的清半夏缓和刺激性效果更佳，处方二与处方一的区别在于处方一中增加了面粉和少量的六神曲。现代各地方炮制规范中半夏曲的处方中90%以上都加了面粉和六神曲（或六神曲的原辅料）两味（或多味）药作为发酵的辅料。课题组认为面粉的加入可以为发酵提供更多碳、氮和其他能源，使发酵更快、质量更好；半夏曲发酵后增加了消食的功效，六神曲是消食的常用药，半夏曲处方中六神曲的加入可以更好地提高半夏曲消食的功效。因此处方中加入面粉和六神曲是合理的。
综合毒性、刺激性、药效实验及发酵工艺和现代市场多方面考虑，本课题组选择了处方一也就是按照部颁标准处方发酵的半夏曲作为课题组后面半夏曲功效和成分研究的最终处方。
（二）发酵过程研究
1.半夏曲发酵过程样品制备
在查阅相关文献资料、调研四川辅正药业股份有限公司和四川新荷花中药饮片股份有限公司等相关生产厂家、咨询相关的中药发酵炮制方面的老药工及成都中医药大学的炮制专家后，确定了半夏曲的发酵炮制工艺为：取清半夏、六神曲、白矾粉碎成细粉，生姜汁加适量水（约5倍量的水），与面粉及上述细粉搅匀，制成软硬适宜的颗粒，置于适宜容器中并覆盖薄膜，在温度为30℃左右、湿度约为80%的环境下发酵，每隔一定时间取样一次，并随行记录其状态，发酵至产生“黄衣”时即为炮制终点（100%），取出，置于50℃的烘箱中干燥，备用。
2.发酵过程中物质基础及“性状”变化的分析
（1）碳、氮源分析：通过分析半夏曲发酵过程总糖和总蛋白的含量变化可以从侧面反映微生物对碳、氮源利用情况。
1）总糖分析：半夏曲发酵过程中总糖含量先缓慢增加，而后呈下降趋势，可能是发酵初期，大分子糖类慢慢被微生物所产生的淀粉酶降解生产可溶性的糖类，而后随着微生物发酵的进行，糖类被微生物所消耗提供碳源以保证微生物的正常生长和繁殖。
2）总蛋白分析：随着半夏曲发酵时间的延长，样品中总蛋白的含量整体呈下降趋势，在发酵初期总蛋白的含量下降很少，在发酵中后期总蛋白的消耗很明显，这可能与发酵过程后期微生物大量繁殖，产生“黄衣”需要消耗大量的氮源有关。
（2）酶活力测定
1）淀粉酶活力：半夏曲在发酵过程中淀粉酶活力逐渐增强，其中从发酵初期B1（0%）到B2（25%）淀粉酶活力增长缓慢；从B2（25%）到B3（50%）淀粉酶活力显著增加，可能是此时酵母类微生物大量繁殖并产生较多的淀粉酶，从而大量分解半夏曲中的淀粉转化成糖类，为微生物的代谢提供碳源，与发酵过程中的碳源变化趋势基本吻合；发酵后期淀粉酶活力增长缓慢，可能与半夏曲自然发酵后期优势微生物发生改变有关。
2）蛋白酶活力：半夏曲发酵过程蛋白酶活力随发酵时间的延长呈增强趋势，从B1（0%）到B2（25%）酶活力增长缓慢，从B3（50%）到B4（75%）酶活力上升很快，发酵后期基本达到平衡状态，这与半夏曲发酵过程中总氮源的变化趋势相呼应。
3）脂肪酶活力：脂肪酶活力变化呈下降趋势，在半夏曲发酵初期脂肪酶存在可能是由于原料中含有六神曲；在发酵过程中脂肪酶活力一直减少，可能的原因是半夏曲培养基中基本不存在脂肪类成分，且脂肪酶作为蛋白质类成分，可能作为碳氮源被微生物所利用。
3.发酵过程特征指纹图谱分析
通过对半夏曲发酵过程特征指纹图谱分析发现，在半夏曲发酵过程中1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、19号色谱峰所代表的化合物为半夏曲原料本身中所含有的化学成分。其中峰2、峰3和峰4所代表的核苷类化合物既是微生物生长与繁殖所必需的原料，也是其代谢产物，对于这3种核苷类化合物在自然发酵过程中的变化规律还有待进一步研究；而11、12、13、14、16、17、18号色谱峰均是在S4～S5（75%～100%）产生，且11、12、13、14号色谱峰的峰面积非常明显，反映其成分含量较高，这可能是在接近发酵终点（“黄衣”上遍）时微生物代谢产物急剧增加，后期可通过LC-MS或其他分析手段对11、12、13、14号色谱峰（新产生的化合物）进行分离与结构鉴定，可将其作为指标从化学成分方面对半夏曲发酵与否进行鉴别。
4.基于机器视觉技术的半夏曲发酵过程颜色变化分析
目前有关中药颜色方面的量化研究，多采用色彩色差计、机器视觉等对颜色进行客观量化，其中机器视觉具有检测速度快、精度高、可扩展性好的优势，对中药材样品进行颜色测定时，可不受样品形态的限制，更适合用于中药性状颜色的客观量化。
将保存的图像导入“新药工中药成像分析系统”软件进行颜色特征提取，分别输出颜色L、a、b值，将每个样品的3次平行的Lab颜色值用于最终的数据分析，其中L表示亮度（黑白），a表示从绿色至红色的范围，b表示从蓝色至黄色的范围，L、a、b共同构成一个三维颜色空间。根据现代公认的颜色视觉Lab理论，每一个颜色都可以在三维颜色空间中找到相应的坐标，因此，需要结合化学计量学方法对半夏曲发酵过程不同时间节点的样品颜色（L、a、b值）的变化规律进行综合分析。
SQC（统计质量控制方法）分析是在考虑样本的差异性的基础上，通过计算参考样本得出接收区域和拒绝区域。对每一个数据点而言，在单元内的距离表明了颜色的差异。本实验以B1（0%）为参考样本，将其他样品与其进行SQC分析。
在半夏曲发酵过程中，从B1（0%）到B4（75%）样品颜色的亮度、色彩缓慢变化；从75%～100%样品颜色发生明显改变，主要原因可能是此时样品开始产生“黄衣”，即产生黄色的微生物代谢产物，使样品样色变黄，这也从颜色方面反映出发酵终点样品颜色与未发酵样品存在明显的颜色差异。
5.基于电子鼻技术的发酵过程气味变化分析
“气味”作为中药饮片的固有属性之一，亦是中药饮片的质量标准的重要指标。本研究拟通过电子鼻技术对半夏曲发酵过程样品的气味变化进行客观化的定性分析。
将电子鼻传感器获取的样品响应值进行SQC分析，以B1样品为参照对象，将其他样品与之进行比较，探索半夏曲发酵过程的气味的变化规律。
结果显示，半夏曲发酵过程中的气味特征综合响应呈现一定的变化规律，从半夏曲发酵过程B1（0%）到B2（25%）气味变化不明显；在发酵至过程B3（50%）时，气味变化非常明显，这可能是在发酵过程中产生的“酒香气”，且电子鼻传感器对酒精类具有很高的响应值；发酵过程B4（75%）到B5（100%）气味与B1到B2气味有明显差异，分析原因可能与发酵后期产生特异香气有关。
（三）半夏曲纯种发酵与传统发酵的比较
半夏曲的发酵目前采用的是传统自然发酵，自然发酵由于没有进行严格的无菌控制，发酵过程环境中的多种微生物参与发酵，导致不同发酵环境发酵的半夏曲差异较大。因此本课题在半夏曲已经筛选出优势菌种的基础上进一步研究，采用优势菌种对半夏曲进行纯种发酵，以半夏曲的外观性状、内在成分、毒性、刺激性和药效为评价指标，比较传统发酵与纯种发酵工艺对半夏曲质量的影响，优化半夏曲发酵炮制工艺。
1.发酵方式
（1）传统发酵：取清半夏、白矾、六神曲粉碎成细粉，生姜榨汁加适量水，与面粉及上述细粉搅匀，制成软硬适宜的小块或颗粒，置37℃的恒温恒湿箱中发酵培养3天（RH75%），发酵至产生“黄衣”时，取出，冷冻干燥机中冻干，即得。其处方为清半夏160g，白矾10g，六神曲5g，生姜汁20g，面粉32g。
（2）纯种发酵：原料同上，混匀，分装于500mL烧杯中，分别加姜汁和水的混合液体30mL，搓成颗粒状（握之成团，触之即散），再分装于250mL广口瓶中，加塞，用牛皮纸封口，置高压蒸汽灭菌锅中于121℃灭菌20min，放冷后备用。
将购买的枯草芽孢杆菌、黑曲霉和季也蒙毕赤酵母菌分别按照说明书的方法复活，分别挑取培养后长出的单个菌落，接种到各自适宜的培养基平板上，置28℃或37℃培养箱中继续培养一代，待菌落长出后，用显微镜涂片染色法检查是否是单一微生物，若不纯，再依法反复稀释，直至获得纯培养物，纯培养物在无菌条件下用10mL无菌水将斜面上孢子冲洗下来，并稀释至2×105spores/mL备用。
在无菌条件下，将上述孢子悬浮液以每瓶6mL的接种量均匀地接种到已经灭菌的曲料中，加棉塞，置37℃的恒温恒湿箱中发酵培养3天（RH75%）。发酵结束后，将曲料取出，并于冷冻干燥机中冻干，即得。
2.评价项目
选择半夏曲饮片外观性状、气味、内在成分、毒性、刺激性和药效等几项综合加权评分作为评价指标。
实验结果表明，不同孢子混悬液发酵后的样品外观性状、内在成分总有机酸含量和传统发酵后半夏曲样品比较，都是符合质量标准的。外观性状上课题组选择了直接观察的方法，为了更精确地比较各样品间性状与气味的差别，可以选用机器视觉技术和电子鼻等技术以数据的形式更准确地比较。内在成分含量选择了总有机酸一个成分比较单一，可以在确定了半夏曲的消食的有效成分后，进行多指标成分的比较。
家兔眼结膜刺激实验结果表明，传统发酵和纯种发酵均表现为无刺激性，说明传统发酵和纯种发酵两种发酵工艺都可以缓和半夏的刺激性。
药效方面，枯草芽孢杆菌、黑曲霉和季也蒙毕赤酵母菌为菌悬液发酵的半夏曲和传统发酵的半夏曲治疗效果相当，差距很小。下一步的实验可能需要更多和更精确的实验从药理和物质基础上具体地分析传统发酵和纯种发酵的不同。
综合以上几个实验结果和最终评分，可知以枯草芽孢杆菌为菌株进行纯种发酵优于传统发酵工艺。枯草芽孢杆菌是一种革兰阳性菌，被美国食品药品监督委员会称为“CRAS”（generally regarded as safe），即益生菌。枯草芽孢杆菌应用比较广泛，可用于工业污水处理、宠物养殖、水产养殖等多个领域。枯草芽孢杆菌能够保护肠道上皮细胞免受损伤，维持肠道稳态，分泌的抗菌肽物质可以抑制结肠癌，产生的消化酶能够促进小肠的消化吸收，恢复肠蠕动功能。枯草芽孢杆菌添加到饲料中对动物的肥育效果很好，说明可以很好地促进动物胃肠道的消化，与本课题研究的半夏曲主要消食药效是相同的，所以选用枯草芽孢杆菌为半夏曲纯种发酵的菌种，不仅可以保证良好的质量，还可以对药效有协同的作用。
五、药效物质基础研究
（一）半夏曲止咳化痰药效研究
半夏具有燥湿化痰、降逆止呕、消痞散结的功效，目前只有文献报道过不同处方对半夏曲消食药效的研究，并未见对其止咳化痰药效的比较。因此课题组选用了小鼠*水氨**诱咳模型、豚鼠枸橼酸模型、小鼠酚红排痰模型和大鼠排痰模型四个较为经典的模型对半夏曲的止咳化痰功效进行了研究，证实发酵炮制工艺可以保留半夏止咳化痰的功效。
1.半夏曲止咳药效研究
小鼠*水氨**诱咳实验和豚鼠枸橼酸实验结果均表明，半夏曲具有明显的抑咳作用，能有效地延长咳嗽潜伏期，抑制咳嗽次数。半夏曲同发酵前辅料清半夏比较，清半夏的止咳效果更好一些，这可能与发酵过程中某些物质的变化有关，需要进一步研究发酵过程物质基础的变化来解释这种结果。半夏曲止咳的效果虽然没有清半夏强，但与空白组比较还是有显著抑咳效果的，可以用于临床上治疗咳嗽的症状。
2.半夏曲化痰药效研究
小鼠酚红排痰实验和大鼠排痰实验结果表明，半夏曲和清半夏及羧甲司坦都不能明显地增加鼠的排痰量，但都有增加排痰量的趋势。课题组选择的两个模型实验结果不能很好地验证清半夏和半夏曲的化痰功效，可能这两个模型不适合半夏的化痰机制，课题组下一步需要选择更好的实验来验证半夏曲是否有很好的化痰功效。
（二）半夏曲消食化积药效研究
《本草纲目》记载半夏曲有化痰湿、消食滞之功，发酵后增加了消食滞的功效。现临床多用于治疗恶心呕吐，食欲不振，咳嗽痰壅。目前对半夏曲的研究主要集中在发酵前后的化学成分变化、处方研究和微生物研究。以清半夏与姜汁、白矾等为发酵处方的半夏曲治疗脾虚食积的研究未见报道。本课题主要研究部颁标准半夏曲对正常小鼠和脾虚积滞模型小鼠胃肠道运动的影响，为进一步说明半夏曲发酵后可以增加消食滞的功效提供理论依据。
通过比较半夏曲发酵前后对正常小鼠及脾虚积滞模型小鼠胃肠运动的影响，发现半夏曲发酵后较发酵前确实能更好地促进小鼠的胃肠运动，改善小鼠的消化功能。说明半夏曲发酵后对脾虚积滞证有一定的治疗效果，可以用于临床上治疗脘腹胀满、食欲不振、脾胃虚弱的患者。课题组前期研究中发现在半夏曲发酵的过程中消化酶的活力增加，一个原因可能是半夏曲发酵后增加了消食的功效。目前有关发酵后可以产生或增强消食功效的具体机制和原理还不清楚，需要今后进一步的研究。课题组下一步将从半夏曲发酵后消食功效有效部位的确定、有效部位的特征图谱和有效部位与消食功效的谱效关系几个方面更全面地阐述半夏曲发酵后增加了消食功效的物质基础。
六、药效学及安全性评价
1.发酵对半夏毒性和刺激性变化的影响
目前对半夏的毒性成分研究尚存在争议，普遍认为主要的毒性成分为草酸钙针晶、蛋白类和生物碱类。其中草酸钙针晶为半夏的主要刺激性成分，蛋白类中的凝集素蛋白为主要的致炎性成分，生物碱类既是抑制相关肿瘤细胞增殖的有效成分，又是能够产生急性毒性的成分。炮制可以缓和半夏的毒性，目前对半夏发酵制曲后可以缓和半夏毒性的研究未见报道，所以本课题拟采用单次给药毒性实验方法、家兔眼结膜刺激性实验方法和高效液相色谱法对半夏发酵前后的毒性变化进行研究。对于草酸钙含量测定的方法目前多用滴定法和HPLC，二者都是将不溶的草酸钙转化为草酸的方法间接测定草酸钙的含量，本实验选择了操作简单、结果更准确的HPLC。
实验结果表明，急毒实验中半夏MLD为45.47g/（kg·d），相当于临床人用量的252.61倍，发酵后的半夏MLD为39.42g/（kg·d），相当于临床人用量的218.96倍，说明半夏发酵前后在正常的临床用药范围内都是低毒的、安全的；家兔眼结膜刺激实验中，半夏可引起家兔眼结膜红肿并伴有分泌物排出，这说明半夏有刺激性，而发酵后的半夏较半夏对家兔眼结膜的刺激性明显减弱；草酸钙含量测定实验中，发酵后的半夏草酸钙针晶含量相对减少，说明发酵可以降低半夏中的刺激性成分、缓和半夏的刺激性。
2.半夏曲止咳化痰药效的研究
与模型（空白）组比较，半夏曲及清半夏都能够延长小鼠咳嗽的潜伏期、减少咳嗽的次数，清半夏更明显（P＜0.05）；半夏曲高剂量可以明显地减少小鼠咳嗽的次数（P＜0.05），并且有明显延长咳嗽潜伏期的趋势（P＜0.05）；半夏曲及清半夏可以使小鼠气管段酚红含量增加，但没有明显的效果（P＞0.05）；清半夏可以明显增加痰液的排出（P＜0.05）；半夏曲有增加痰液排出的趋势，但效果不是很明显。
3.半夏曲消食药效的研究
模型组与空白组比较，肠推进率和胃排空率明显降低（P＜0.05）；与模型比较，半夏曲发酵前后均能提高正常小鼠的肠推进率和胃排空率；与空白组比较，半夏曲发酵前后的肠推进率和胃排空率逐渐恢复至空白组的水平。对脾虚食积小鼠肠推进率恢复程度顺序为：吗丁啉组＞健胃消食片组＞半夏曲高剂量组＞半夏曲中剂量组＞半夏曲低剂量组＞半夏曲发酵前组＞模型组；对脾虚食积小鼠胃排空率恢复程度顺序为：健胃消食片组＞吗丁啉组＞半夏曲高剂量组＞半夏曲中剂量组＞半夏曲发酵前组＞半夏曲低剂量组＞模型组。健胃消食片组、吗丁啉组、半夏曲高剂量组与模型组比较有显著性差异（P＜0.05），说明发酵后的半夏曲能明显提高脾虚食积小鼠的肠推进率和胃排空率，对脾虚食积小鼠的胃肠运动情况有所改善。
与模型组比较，健胃消食片、吗丁啉、半夏曲高剂量能够显著促进胃肠道的运动，增加胃肠道激素胃泌素及神经递质胆碱酯酶的分泌，减少一氧化氮的分泌；与空白组比较，健胃消食片组、吗丁啉组及半夏曲高剂量对胃肠道的运动有所恢复，半夏曲中低剂量组、半夏曲发酵前组及模型组恢复不明显。说明半夏曲发酵后可以促进胃肠道的运动。
七、质量标准提升研究
目前部颁标准第十册中半夏曲的质量标准仅对性状、鉴别、检查做了简单的规定，未能充分体现处方中主要药物清半夏等的质量要求，为了科学评价和合理控制半夏曲的质量标准，本部分将按照中国药典有关中药饮片质量标准起草项目要求，从制法、性状、鉴别、检查、浸出物、含量测定、其他等项目内容进行全面研究，提升半夏曲的质量标准，为新版部颁标准或其他相关标准的修订或制定提供数据支撑。
1.来源与制法
（1）来源：半夏曲为天南星科植物半夏Pinellia ternate（Thunb）Breit.的炮制品清半夏加面粉、姜汁、白矾和六神曲经发酵而成。
（2）处方
传统处方：清半夏160g，白矾10g，六神曲5g，生姜汁20g，面粉32g。
纯种发酵处方：清半夏7207g，面粉1442g，生姜900（榨成1g/mL的姜汁），白矾450g，枯草芽孢杆菌（稀释至2×105spores/mL备用）。
（3）工艺
传统工艺：取清半夏、白矾、六神曲粉碎成细粉，生姜汁加适量水稀释（约5倍量的水），与面粉及上述细粉拌匀，制成软硬适宜的小块或颗粒，置于适宜容器中并覆盖薄膜，在温度30℃左右、湿度约80%的环境发酵，发酵至产生“黄衣”时，取出，干燥，即得。
纯种发酵工艺：将曲料用和面机混合均匀，少量多次用紫外灯灭菌，在无菌条件下，将孢子悬浮液以270mL的接种量均匀地接种到已经灭菌的曲料中，用和面机混合均匀，分别放在三个灭菌的收纳箱中，置37℃的恒温恒湿箱中发酵培养3天（RH75%）。发酵结束后，将曲料取出并于50℃烘箱中干燥，即得。
（4）中试产品：本实验所用的中试产品为四川辅正药业股份有限公司和四川新荷花中药饮片股份有限公司按照半夏曲的传统和纯种发酵炮制工艺进行中试放大生产，各3批次。
（5）样品收集信息：为了提升半夏曲的质量标准，收集了全国主要的生产厂家的样品。共收集了10批样品，其中4批为中试产品，其他为购自具有生产批准文号的企业。
2.性状
半夏曲饮片的性状为黄白色至淡黄色的小块或粗粉；气微，味酸涩、微辣。
3.鉴别
显微鉴别结果表明，10批半夏曲饮片均可见淀粉粒和草酸钙针晶，与部颁标准第十册的半夏曲显微鉴别结果相同。
薄层色谱鉴别（1）中，半夏曲的薄层色谱中均能检出4种氨基酸，阴性无干扰，且水半夏伪品不含有精氨酸，故以4种氨基酸对照品作为对照，可做半夏曲的薄层鉴别，专属性较强。薄层色谱鉴别（2）中，参照中国药典中的半夏及清半夏的薄层鉴别（3）的方法，薄层斑点清晰，专属性较强。两种薄层方法联合使用，可更好地用于鉴别半夏曲的真伪，较部颁标准半夏曲的鉴别项有明显提高，故将两种TLC鉴别方法均列入“半夏曲质量标准草案”正文鉴别项下。
清半夏、半夏曲、混合半夏曲、样品1号均有香草醛硫酸显色反应，因此暂不考虑将其作为鉴别项的内容列入“半夏曲质量标准草案”中。
4.检查
检查项下规定的项目要求指在加工、生产或贮藏过程中可能含有并需要控制的物质包括重金属、干燥失重、水分、杂质、灰分、总灰、黄曲霉毒素等或其限度指标。
（1）水分：水分指中药饮片中所含“自由水”的多少，是保证饮片质量的重要参数。含水量太高，易变质生霉，不利于饮片贮藏。因本半夏曲样品中不含或少含易挥发性成分，故可采用烘干法进行直接测定。
10批半夏曲样品平均水分含量为10.23%，最高水分含量为11.91%，最低水分含量为8.65%。发酵炮制品因质地较轻且松疏易吸潮，在贮藏过程中水分含量会有所上升，再加上我国地域广阔，温湿度具有差异性，结合《中国药典》（2015年版）对中药饮片含水量的要求，综合考虑暂将半夏曲的水分定为不得过13.0%，并将此结果收录入半夏曲质量标准草案正文检查项下。
（2）灰分：灰分间接反映了中药饮片含杂质的多少，亦是中药饮片质量标准中的重要参数。
10批半夏曲的总灰分平均值为4.42%，最低为3.97%，最高为5.40%。按照中药饮片质量标准的制定原则，暂规定半夏曲的总灰分不得过5.5%，并将结果列入本品质量标准草案正文检查项下。
10批半夏曲的酸不溶性灰分的平均值为0.48%，最低为0.38%，最高为0.64%。按照中药饮片质量标准的制定原则，暂规定半夏曲的酸不溶性灰分不得过0.6%，并将此结果列入半夏曲的质量标准草案正文酸不溶性灰分的检查项下。
（3）白矾限量检查：半夏曲处方中的清半夏和白矾均含有铝盐。现代文献研究表明，Al3+能在肝、肾、脑等脏器蓄积，具有神经毒性，所以应该限定半夏曲中白矾的含量。参考《中国药典》2015年版一部中清半夏、姜半夏、制天南星中白矾限量的测定方法进行测定。
10批半夏曲中白矾含量的平均值为9.67%，最高为10.82%，最低为7.46%。综合考虑各批次的含量差异和处方中的白矾来源，暂规定半夏曲中白矾含量以含水硫酸铝钾计，不得过12.0%，并将此结果列入半夏曲质量标准草案正文白矾限量检查项下。
（4）黄曲霉毒素：因目前半夏曲主要采用传统发酵方式生产，而自然发酵过程在微生物方面难以控制，很容易受杂菌的污染。半夏曲发酵过程中产生“黄衣”，通过初步微生物鉴定，可判断是黄色曲霉类，不但影响其疗效，还具有很强的致癌、致畸和高毒性，因此有必要在质量标准中增加黄曲霉毒素的检查，以保证临床用药的安全性。本实验采用《中国药典》（2015年版）四部黄曲霉毒素测定法（通则2351）第一法（高效液相色谱法）对半夏曲进行黄曲霉毒素检查实验。
10批半夏曲样品中未检出4种黄曲霉毒素，可能是样本量太少。考虑到目前半夏曲的生产方式为传统发酵炮制，生产条件简单，仍然以自然发酵为主，存在易被产黄曲霉毒素的曲霉感染的风险，因此为了保证半夏曲的用药安全，还是有必要对黄曲霉毒素进行规定，按照中国药典对黄曲霉毒素的有关要求，暂列入本品的质量标准草案正文中。
（5）浸出物测定：通过对溶剂及浸出方法的考察，最后确定半夏曲的浸出物测定方法为以稀乙醇为溶剂的醇溶性热浸法，本法简单省时。10批半夏曲样品的浸出物含量的平均值为13.20%，最高为15.06%，最低为11.07%。根据中国药典中药质量标准研究制定的技术要求，暂将本品的浸出物含量范围定为不得少于10.0%，并将此结果列入半夏曲质量标准草案正文浸出物项下。
（6）含量测定：文献报道，清半夏中的有机酸类成分具有止咳化痰的功效，因此，测定半夏曲中的总有机酸的含量对保证其质量标准具有一定的现实意义。
因半夏曲中主要以清半夏为主，故参考《中国药典》（2015年版）一部清半夏含量测定项为质控指标，将总有机酸含量作为控制半夏曲的质量评价指标，收录至半夏曲的质量标准草案中，具有一定的可控性，对提升半夏曲的质量标准具有现实意义。本实验结果表明，10批样品总有机酸含量的平均值为0.47%，根据中国药典中药质量标准研究制定的技术要求，暂将本品的总有机酸限度定为不得少于0.35%，并将此结果列入半夏曲质量标准草案含量测定项下。
（7）半夏曲特征图谱：目前有关部颁标准中半夏曲的化学成分研究鲜有报道，但是根据清半夏的现代文献报道，可推测半夏曲中主要含有有机酸类、氨基酸、核苷类、生物碱、多糖、无机盐类等。本研究利用指纹图谱分析技术，对半夏曲中的化学物质进行探索，为有效控制半夏曲的质量提供一种方法。
不同厂家之间样品的相似度很低，但是相同厂家的样品各批次之间的差异性不大。这反映了各厂家间样品之间的差异性很大，其原因可能是样品来源、炮制工艺以及发酵的微生物环境等因素均会对半夏曲中的物质基础产生不可控的影响，故半夏曲的特征指纹图谱暂不列入半夏曲质量标准草案正文中。
（8）其他：半夏曲的功能与主治、用法与用量及贮藏均参照部颁标准所收载的半夏曲的内容，注意项同《中国药典》（2015年版）一部的清半夏饮片。