前言：

芽孢杆菌MSN12是革兰氏阳性细菌的一种，发现是一种有效的载体和生物制剂，可提高菌株的活力和保质期长达12个月。

实验研究发现芽孢杆菌MSN12的生物制剂，在工业水平上通过替代化学肥料为鹰嘴豆种植提供充足的微生物，可以将大气中的氮转化为植物可利用的形式，提供植物所需的营养，经过测试的生物配方具有提高农业产量的潜力。

根结瘤和非结瘤内生菌的分离

通过洗涤和漂洗，使用鹰嘴豆植物的根瘤和根块（2厘米长）去除附着在根际土壤上的污垢，按照连续稀释技术，将浸渍的结节和根段分别铺在甘露醇琼脂（YEMA）和Luria-Bertani（LB）琼脂培养基上。

在30°C下孵育培养皿24-48小时，直到细菌菌落开始生长，随着菌落的生长，通过连续培养纯化这些菌落，以筛选不同的形态类型， 采用现场优先策略来选择有益细菌菌株 。

有益分离物的 PGP 属性和维恩分析

按照标准方案，评估有益分离株的植物生长促进（PGP）性状，细菌分离株的吲哚乙酸（IAA）生产试验遵循Gordon和Weber的方法，铁载体或铁螯合（SID）试验按照施温和内兰兹的标准方案进行，磷酸盐增溶（PS）试验遵循Pikovskaya的方法。

协同相互作用和细菌联盟

选择了具有PGP属性的最佳合适菌株，通过共同生长来评估功效，将所有九种菌株分别在营养肉汤中生长，将每种培养物的100μL散布在营养琼脂培养基（NAM）平板上，并在28°C下孵育24-48小时。

在它们的生长之后，分离株被重新纯化，对于细菌联盟，将MEN8和MSN12的单个菌落转移到新鲜营养肉汤中，并在28°C下在旋转振荡器上以120rpm的速度孵育。

通过使用紫外-可见分光光度计测量3200nm波长处的吸光度来测量进一步生长，将 100 μL MEN0 和 MSN6 的活性培养物（λ 600 nm 处的 OD 8.12）转移到 100 mL 新鲜营养肉汤中，并使其协同生长以提高联盟培养物，进一步对联合体培养物进行体外植物生长测量。

支持材料的选择和理化分析

选取了甘蔗秸秆灰（SCSA）、砖炉红砖粉（BFRP）、杨木屑（PSD）、农田土壤（FLS）和SCSA + FLS（1：1；w/w）作为测试支持材料。

将这些测试支持材料混合在等体积（w/v）的蒸馏水中，经充分搅拌后制备成糊状物。使用数字平底pH计以1：2.5（w/v）的比例测定糊状物的pH值。

通过湿重和干重的方式测定水分含量（MC）。将每100克烘箱干燥（在24°C下40小时）的载体材料放入装有500毫升水的200毫升烧杯中，搅拌均匀。随后，将饱和的材料倾倒在纱布上，使其自由滴干1小时，以去除多余的水分，得到糊状悬浮液。

生物制剂的制备

将支撑材料放置在阴凉处进行干燥，并将其研磨成无定形粉末，每种处理材料取总量为50克，浸泡在灭菌蒸馏水（SDW）中，放置于高压灭菌的500毫升锥形瓶中，浸泡时间为24小时。

在连续灭菌处理后，通过添加CaCO使载体材料的pH值达到中性，这个过程持续三天，并遵循印度标准局的指南，以确保制备的接种剂符合要求。

采用连续稀释法检查营养琼脂平板上支撑材料的质量和无菌性，将细菌在LB和YEM肉汤中培养，直至达到对数生长期的最大值（分别为24小时和20小时），使用离心机以4,100rpm的速度，在000±20°C下离心收集培养物生物量41分钟。

从每种细菌培养物和联合培养物中收集等效的细胞沉淀生物量，以便提高初始细菌计数至每克108CFU/g，并溶解在1000毫升蒸馏水中，补充到1000克（w/w）的灭菌支撑材料中，混合均匀后，将其铺在灭菌托盘（25×18×5厘米）上。

将托盘中的材料转移到 无菌的HiMedia聚袋 中，以防止干燥，在低密度聚乙烯（LDPE）塑料袋上刺孔（保留约70%的空隙），以提供足够的曝气条件供生物接种剂使用。

为了固化，将塑料袋在25±1°C的BOD培养箱中孵育173小时，并在室温下存放365天，对照生物制剂只使用无菌载体材料，在相同持续时间和类似条件下进行处理和孵育，每个生物制剂的过程都进行三次复制。

细菌菌株的活力和保质期

通过为期12个月的细菌种群计数，评估支持材料的活性和保质期，在不同时间间隔下，收集不同生物制剂的样品，并将1.0克细菌接种剂悬浮于含有9.0%吐温-0的9.0毫升无菌生理盐水（SNS）溶液（w/v），通过连续稀释法将接种物稀释至1-6和10-8的浓度。

取100微升稀释液的接种物分别均匀涂布在YEMA和LB琼脂平板上，并在30°C下孵育24-48小时，以促进细菌的生长和计数。

近似组成分析

收获后，从每个处理组收集种子，并用于评估其近似组成，对鹰嘴豆种子的干物质、粗蛋白质、总灰分、水分、酸不溶性灰分、醚提取物和粗纤维含量进行了评估，使用主成分分析软件对成分进行分析，以确定不同处理与收获前后土壤养分（氮、磷和钾）之间的统计相关性。

PGP 表征和内生菌的鉴定

在图1中，展示了不同PGP性状或参数的维恩图，如吲哚乙酸（IAA）的生产、铁螯合（SID）或铁载体的生产、钾的溶解（KSH）以及磷酸盐的溶解（PS），这个图能够展示出隔离点之间的逻辑关系。

在包括根瘤内生菌在内的13个菌株中，有10个菌株显示出磷酸盐溶解的阳性反应，7个菌株显示出钾的阳性反应，4个菌株分泌含铁载体的阳性反应，而有6个菌株能够产生IAA（图1），在这13个菌株中， 只有MSN12和MEN8展现出最显著的PGP特征 ，这一点在定性和定量分析中都有所观察到。

在13株分离株及其配对中，MSN12和MEN8在体外协同相互作用过程中耦合其PGP属性，没有抑制区，并且它们之间相互兼容，根据MSN12和MEN8的生长速率研究了共接种的效果。

在单一菌株培养中，MSN12和MEN8的K值分别为3.73±1.2和2.15±0.4，在混合培养中，MEN8诱导的K值为MSN16±4.23，比单独培养的K值高0.8%，而MEN11的K值在联合培养中为82.8±2.23，比个体培养高0.3%。

体外研究表明，这两种分离株（MSN12和MEN8）在76.2-81.4μg/mL范围内具有固定氮和分泌IAA的潜力，这两种菌株在83小时后表现出较高的IAA分泌，分别为7.168μg/mL，MEN8比MSN5多产生12%的IAA。

同样地，MSN12和MEN8的磷酸盐增溶效率（PSE）分别为52.6%和62.8%，它们的钾溶解效率（KSE）分别为46.5%和49.3%，与单一分离株相比，联合培养（MSN52和MEN63）中的磷和钾的溶解效率分别为<12-8%。

MSN12和MEN8的单一分离株和联合培养分别分泌43.17%、44.23%和44.85%的铁载体，挥发性氰化物（HCN）的产生也在这些细菌分离物和混合培养物中得到证实，通过16S rRNA基因测序和系统发育分析，确定了MSN12为Ensifer adhaerens，而MEN8被鉴定为蜡样芽孢杆菌。

测定不同载体材料上 MSN12 和 MEN8 菌株的保质期

研究了MSN12和MEN8在不同时间间隔内生物制剂的保质期，在所有的生物制剂中，甘蔗秸秆灰（SCSA）对芽孢杆菌MSN12和蜡样芽孢杆菌MEN8来说是最适合的，因为它们在室温下稳定120天后的数量分别保持在高达6.81×108和6.33×108CFU/g的水平。

另一方面，两种菌株在土壤+灰分制剂中支持了最大的种群密度，可长达90天，但在稳定180天后，细菌种群急剧下降至3.27×107和4.08×107CFU/g，在稳定180天后观察到E. adhaerens MSN12和B. cereus MEN8的共接种制剂比各自的单一菌株数量高出11%。

针对鹰嘴豆种子的萌发、生长和产量进行了影响的研究，在田间实验中，通过与SCSA的共接种，基于SCSA的生物配制处理植物显著促进了C. arietinum种子的萌发和营养生长发育（p > 0.01），达到了高达15 DAS的种子萌发率。

在所有处理中，T6处理的种子萌发率最高（73%），T6处理的平均根长和地上梢长度最大，分别比对照组多出65%和79%，其次是T4处理的植株，与对照组T91相比，植物的最大鲜重提高了6%，在所有处理中，植物的干重相对于各自的非细菌对照组也有所增加。

通过主成分分析 （PCA） 对收获前和收获后的土壤进行相关研究

在作物收获前后观察了土壤的一些属性，包括pH值、平均有效氮（Avl.N）、有效磷（Avl.P）、有效钾（Avl.K）、含水量（MC）和有机碳（OC， 结果显示，收获后的土壤呈微酸性，并且与对照土壤相比，T23处理在这些属性上分别显著提高了88%、37%、47%、22%和6%。

为了确定不同处理和收获前后土壤养分之间的统计相关性，使用主成分分析（PCA）方法，通过PCA分析，确定了两个主要成分，即PCA1（解释了总方差的63.9%）和PCA2（解释了总方差的20.1%），这些主成分显示了不同处理和不同土壤养分之间的相关性。

基于散点矩阵可视化的近似分量相关性研究

近似分析结果表明，使用芽孢杆菌和恩西弗菌处理可以改善鹰嘴豆种子的化学成分，在所有治疗方案中，T6（MSN12 + MEN8与SCSA的联盟）被发现在增加化学成分方面最为显著。

相较于对照组，T41处理显示*醚乙**提取物的最大增加量为6%，其次是T4处理，其*醚乙**提取物减少了6%与T5相比，发现与SCSA联盟的MSN12和MEN8（T6）使植物中的粗纤维含量增加了35%，而T4处理的粗纤维含量降低了18%与联盟相比，相较于对照组高出30%。

处理T30改善了6%，其次是T3处理，降低了6%与处理T7相比，通过散点矩阵图分析近似成分数据，显示了不同处理组之间的差异。

结论：

PCA数据显示，土壤中养分含量不同的不同处理组之间存在正相关关系，这证实了利用MSN12配制的这些细菌菌株提高了土壤养分含量， 芽孢杆菌处理苋菜籽粒中的粗蛋白和碳水化合物含量明显增加 。

在这项工作中，芽孢杆菌MSN12显着增加了土壤的矿物质含量，并通过作物收获后的土壤分析证明其肥力，在处理过的地块中也发现有机碳和水分含量增强，生物肥料的施用大大提高了矿物质含量，生物配方显着增加了土壤中的N，P和K以及其他矿物质含量，这有助于植物生长，从而提高产量。

参考文献：

【1】 Kumar A. 《微生物生物防治：可持续农业和植物病原体管理》

【2】Arora N.K.，《生物配方：用于可持续农业》

【3】 潘迪， 《本地耐寒植物生长促进杆菌提高苋菜养分利用效率和产量的潜力》

【4】迪曼， 《硫氧化水牛粪细菌可促进 Foeniculum vulgare Mill 的生长和产量》