文丨七号记
编辑丨七号记
在牛中，编码黑皮质素受体1（MC1R）的基因，已知是两种毛色色素之间切换的主要调节因子：真黑素（黑色素）和黑色素（红色素）。夏洛莱（Dc）的稀释突变是该品种白色毛色的原因。使用F2-回交夏洛莱×荷斯坦种群，其中包括具有两种色素背景的动物，我们提出了 夏洛莱稀释位点的链接映射研究。
并且，我们还通过 F2 和平衡回交设计，获得的夏洛莱×荷斯坦实验群体进行了基因组扫描，以定位负责稀释表型的遗传位点。连锁分析包括具有 黑色和红色毛色背景的个体 ，因此解决了夏洛莱品种中参与phae黑色素稀释的主要位点的定位。
一、真黑素和黑素稀释液的连接分析结果
主要基因效应的证据。对二元颜色性状（白色、灰色、浅红色、深红色和黑色）的初步分析显示，对5号染色体和18号染色体有非常显著的影响（数据未显示）。随后对颜色类别进行分组，以给出与稀释表型相关的组合性状： 定量稀释，定量黑色和定量红色。
在稀释相关性状和灰色强度性状中检测到的显著关联。对于每个显著的关联，位置和基因效应估计值（加性和优势）都是详细的，牛5号染色体上影响夏洛莱杂交中真黑素和素稀释的位点的联系证据。
为5号染色体上的稀释相关性状定量稀释，定量黑色和定量红色获得F比率图。虚线表示信息内容（右 y 轴），标记位置标识为 x 轴上方的三角形。在所有情况下，统计概况的峰值两侧是标记ETH10和DIK5248，定量黑色的自举 95% CI 表示为 x 轴上方的灰色框。根据我们的连锁分析，SILV基因的位置在x轴上表示。
对于三个稀释相关的性状，加性和优势估计的标志和大小表明，荷斯坦等位基因的两个拷贝会使动物变黑（黑色或深红色），而夏洛莱等位基因的两个拷贝会产生白色动物。对于这三个性状 ，加性效应远高于负优势效应 ，表明在大多数情况下，杂合子被评分为中间表型（灰色或浅红色）。夏洛莱等位基因的轻微优势（仅对定量黑）显着，表明一些杂合子被评分为白色。
SILV基因在黑色素细胞色素沉着的产生中具有已知的功能，包含在这些显着关联的置信区间中，因此看起来是一个强有力的候选者。位于该基因的第一个外显子（SILV c.64A>G）编码区[GenBank：EF64]，位置的第一个外显子中的非同义突变仅在夏洛莱品种中发现，并被认为 是该品种毛色稀释特征的致病突变。
对第二代个体的这种突变进行了基因分型，并测试了这种突变与对19号染色体的显着影响的可能关联。当SILV c.5A>G突变作为固定效应被纳入回归模型时，最初为64号染色体上的稀释相关性状确定的全基因组显着效应不再显着。
二、轻微的基因效应
除了对5号染色体的巨大影响外，初步分析还确定了 定量稀释和定量红 在28号染色体上的连锁关联，超过了Lander和Kruglyak定义的暗示连锁阈值，对于牛基因组，这对应于染色体宽的p值<0.034。
这些关联显示出显着的加性效应，阴性符号表明该位点的夏洛莱等位基因，增加了色素的存在。当将SILV c.64A>G变体作为固定效应添加到模型中时，在定量稀释和定量黑色的1号染色体上，也分别检测到染色体15和<>的全染色体显着效应，尽管两者都没有显着的加性效应。
灰度强度分析揭示了28号染色体近端的一个显着关联，映射到与定量稀释和定量红色初始分析确定的关联相同的位置。然而， 只有优势效应对这种关联是显着的。
SILV c.64A>G 突变结果的基因型。大多数动物获得了SILV c.64G>A突变的基因型，该等位基因变异的基因型分布与颜色评分的关系。一项 REML 分析确定了该突变的表型和基因型之间的显著关联（p 值 < 0.001）。
三个遗传背景组中SILV c.64A>G位点的分离，没有显着偏离假设该突变固定在创始人系中的预期比例（夏洛莱的“A”和荷斯坦的“G”）。SILV c.64A>G突变的基因型后来被包括在5号染色体的连接分析中，该二核苷酸标记映射位于67号染色体连锁图的3.5 cM位置，标记ETH10和DIK5248之间。
三、基因分型和测序分析
对整个种群（F1和第二代杂交动物）进行基因分型，以针对分布在 整个牛基因组 中的微卫星标记，从血液样本中提取DNA。
对整个牛群进行基因分型DMC1R基因的e等位基因，由KBiosciences使用竞争性等位基因特异性PCR系统（KASPar技术）进行。两种测试等位基因中的任何一个缺失，被认为表明存在野生型彩色牛中发现的 任何刺鼠反应 等位基因（E）。
对于大多数具有可用颜色评分的第二代个体（F64，CB2和HB1），获得了SILV基因的c.1A>G变体的基因分型。用于扩增外显子5' ACTGTCAATGAGTAGCAGGATGTC 3'和5' TGCACCCAAATCTTCATGTG 3'（434 pb片段大小）。
使用ScfI酶进行限制性酶切，以区分c.64A>G位置处含有A核苷酸的等位基因（产物未被限制性内切酶切割，从而产生单个条带）和含G的等位基因（存在限制性位点并产生244和189 bp的两个条带）。
重建5号染色体的连锁图谱，包括二核苷酸标记SILV c.64A>G，基于表型颜色评分（黑色和深红色：dc dc;灰色和浅红色：直流电;白色：直流直流）。两个位点的创始人的基因型是 根据品种之间固定差异的假设推断的 （即夏洛莱固定为“A”和Dc，荷斯坦固定为“G”和dc）。进行了CHROMPIC分析，以识别可能表明基因分型、或表型分类错误的不太可能的双重重组事件。
牛SILV基因的编码区， 在16个具有不同毛色的第二代个体中测序。 基于基因mRNA序列[GenBank：EF065525]和基于牛基因组序列组装（Build 007303.3）的基因，完整DNA序列[GenBank：NC_1]设计了扩增牛SILV基因21个外显子的引物。
每个外显子使用一对测序引物，但外显子除外，外显子3730为其设计了三对引物，PCR产物使用ABI PRISM染料终止子循环测序试剂盒进行测序，并加载到ABI PRISM <> DNA测序仪上，使用BioEdit程序检查，对齐和比较序列。
四、方法
夏洛莱公牛与纯种荷斯坦奶牛杂交产生的总共 137 只 F1 动物，用于产生 501 只第二代动物：315 只 F2 个体和 186 只互惠回交个体（88 个夏洛莱回交，CB1 和 98 个荷斯坦回交，HB1），对该种群的第二代动物进行 毛色的表型评分 。
最初定义了 七个不同的毛色子类别 ：白色，灰白色，浅灰色，灰色，浅红色，红色和黑色。这种颜色的选择是为了尽可能克服，由于颜色的细微差异和得分年龄差异引起的错误分类，通过与彩*图色**表的视觉比较，对动物进行评分并拍照，后来使用照片确认了视觉评分。
使用基因型数据验证谱系，由于有时很难明确地将动物分配到其中一个颜色类别，因此后来定义了以下 五个类别： 白色（包括白色和灰白色动物），灰色（浅灰色和灰色）、浅红色、深红色和黑色，正是在这些颜色类别上进行了主要分析。
按照Hirooka等人采用的方法，来自五类颜色评分的数据被转换为二元特征，每个类别的表达式编码为1，非表达编码为0。因此，浅红色动物被编码为0 0 1 0 0 五种颜色类别 （白色，灰色，浅红色，深红色和黑色）。
为了进行分析，我们假设夏洛莱稀释（Dc）位点在该群体中以先前记录的遗传模式（即杂合子动物显示出中等稀释水平）进行分离，因此颜色数据也被浓缩为两个特征，称为“定量黑色”和“定量红色”，目的是量化夏洛莱对两种黑色素色素（真黑素和胡黑色素）的稀释作用。
“定量黑色”包括白色，灰色和黑色，但不包括浅红色和深红色个体。定量红色包括白色，浅红色和深红色个体。组合性状“定量稀释”包括 黑色和红色 颜料：完全稀释的动物（白色，编码为1），部分稀释的动物（灰色和浅红色动物，编码为2）和没有稀释效应（深红色和黑色，编码为3）。
在观察稀释类别（灰色和浅红色）中的各种强度后，我们进一步定义了称为“灰色强度”的二元特征，其中仅包括两个灰色子类别（浅灰色，1和深灰色，2），它们被合并为 “灰色” 进行主要分析。
五、统计分析
五类数据集 （白色、灰色、浅红色、深红色和黑色），将观察到的每个类别中包含的个体比例，与在创始人系中固定替代等位基因的假设下计算的比例进行比较（夏洛莱基因型：Dc/Dc;荷斯坦基因型：dc/dc），使用χ++2-假设夏洛莱稀释位点处的杂合子显示中间毛色。分别测试了三类遗传背景（CB1，HB1和F2）的频率分布。CB1和HB1组分别针对1：1（白色：苍白）和1：1（深色：苍白）比率（1 d.f.）的预测分布进行测试，在所有三种稀释表型类别（2：1：2，深色：苍白：白色;1 d.f.）中测试了F2个体的分布。
相同的方法测试三个遗传组中SILV c.64A>G突变获得的基因型比例， 反对在创始人系中固定替代等位基因的假设。实验变量对毛色的影响也使用GenStat中，实施的残差最大似然分析（REML ）进行了研究，该方法还用于研究SILV c.64A>G等位基因变异与资源人群中观察到的毛色稀释变异的关联。
从微卫星数据中获得的联系图，并假设在DC位点的替代等位基因的创始人系是固定的。它使用QTL Express 进行组合性状：定量稀释，定量黑色和定量红色，对于所有性状，将遗传背景（F2，CB1和HB1）视为固定效应，将具有加性和优势效应的单个QTL模型拟合到染色体上每厘米摩根的数据中。
对于每条染色体，在统计概况达到最大值的位置计算F比值和QTL效应。QTL效应的加性成分估计为荷斯坦和夏洛莱等位基因纯合子之间表型差异的一半， 加性效应的正值 表示荷斯坦等位基因导致毛色表型表达增加。
优势效应计算为杂合子与两种纯合子动物平均值的偏差，当优势效应的标志与加性效应相同时，荷斯坦等位基因优于夏洛莱等位基因，而如果符号相反，则夏洛莱等位基因是显性等位基因。进行定量稀释分析，包括MC1R基因型（ED-，ee，eE）作为固定效果。
为了避免在分析 两种色素特异性性状（ 定量黑色和定量红色）时混合颜色背景，根据其MC1R基因型选择分析中包含的白色动物（即具有ee基因型的动物被排除在定量黑色之外，而具有E基因型的动物被排除在定量黑色之外。+D- 被排除在定量红色之外）。
为了测试SILV c.64A>G突变与5号染色体上，所有稀释相关性状的连锁关联的直接关系，重复基因组扫描分析，包括SILV c.64A>G基因型作为回归模型中的固定效应。后来分析了灰色强度性状，使用SILV c.64A>G基因型作为固定效应（因为数据集包括AG和AA个体）。
夏洛莱品种DC稀释效应的位点定位为 牛5号染色体 ，并证明该位点同时作用于黑色（真黑素）和红色（辉黑素）色素背景。牛SILV基因被评估为该连锁关联的候选者，尽管先前描述的非同义SILV c.64A>G突变。并不能解释所研究人群中的所有表型。
但没有发现令人信服的证据，将其排除为 夏洛莱稀释表型 的致病突变，因此，其他遗传效应，例如在28号染色体上观察到的色素强度，可能会影响该人群的毛色变化，已经确定了这种效应的候选基因LYST。
参考文献
【1】Adalsteinsson S，Bjarnadottir S，Vage DI，Jonmundsson JV：冰岛牛的棕色毛色，由Extension和Agouti基因座生产。J 赫里德。1995, 86: 395-398.
【2】Burchill SA，Thody AJ，Ito S：黑色素细胞刺激素，酪氨酸酶活性以及小鼠毛囊黑色素细胞中正黑素生成和嗜黑素生成的调节。J 内分泌。1986, 109: 15-21.
【3】Lu D， Willard D， Patel IR， Kadwell S， Overton L， Kost T， Luther M， Chen W， Woychik RP， Wilkison WO， Cone RD：刺鼠蛋白是黑色素细胞刺激激素受体的拮抗剂。自然界。1994, 371: 799-802.
【4】Bennett DC，Lamoreux ML：小鼠的颜色位点 - 遗传世纪。色素细胞研究 2003，16： 333-344.
【5】Werth LA，Hawkins GA，Eggen A，Petit E，Elduque C，Kreigesmann B，Bishop MD：快速沟通：黑色素细胞刺激激素受体（MC1R）映射到牛18号染色体。动漫科学杂志 1996， 74： 262.