实验报告书
实验名称：不同浓度桉树精油在海参纤毛虫上的处理效果以及对海参苗种的毒性实验！
一、实验背景
20世纪40年代以来化学农药在植物保护领域中的大量使用为人类带来巨大的经济效益，同时农业领域的成功也带动了水产养殖业中杀虫药物的滥用。很多农药杀虫药被降低浓度直接应用到水产养殖业中，由此引发的环境问题、对非靶向生物的*伤杀**以及害虫抗药性等问题日渐突出，人们已经意识到开发安全、绿色、有效的药物重要性。吴伟等进行了印楝素油对车轮虫杀灭效果的实验，结果表明，随着印楝素油浓度的提高可以有效抑制寄生虫的量和活力。另外有研究表明从豆科植物苦参中提取苦参碱精油同样具有杀灭纤毛虫类寄生虫的作用。以苦参碱精油主要成分的水产用杀虫药已研制出来，并在市场上推广使用，表现出良好的疗效。
近些年来，越来越多的人对用植物提取物来代替合成的杀虫剂显示出浓厚的兴趣，桉叶油就是一种天然的驱杀虫剂，与传统的合成杀虫剂相比具有低毒、低残留、对环境和养殖生物影响小，害虫不容易产生抗药性等优点，同时桉树精油是目前世界上从树叶类提取的各类天然精油中， 数量最多的一种，来源非常广泛。这些优势使其成为现代驱杀虫剂的重点开发对象。
二、动物验证实验背景
海参具有丰富的营养和药用价值，海参养殖的经济意义越来越重要。但是，近年来海参养殖频频发生重大疾病，对海参养殖业造成巨大损失。其中，海参腐皮病是比较常见且多发的疾病，死亡率较高，对海参苗种和成参养殖影响极大。
海参腐皮病又称化皮病，多发于春秋气温比较低的时期，近几年随着养殖密度的升高，养殖环境的恶化以及病原生物的抗药性的增强，出现全年多发的态势。海参腐皮病前期主要是细菌性感染，海参出现局部化皮。海参一旦化皮，水体中的盾纤毛虫会以海参组织为食，短时间内出现爆发式增殖，导致海参大面积化皮死亡。所以要想有效防控海参腐皮病的发生除了针对病原菌进行处理之外，更要注重盾纤毛虫的防控。现在防控盾纤毛虫的主要手段较少，化学农药类虽然有一定的效果，但是对海参的毒性较大，使用不当会导致海参的大量死亡，另外原来有效的药物也逐渐产生抗药性，药效降低。现在急需一种既安全又高效的一种驱杀类药物。
三、实验目的和意义
1、验证桉树精油在防控海参盾纤毛虫上的作用效果；
2、验证桉树精油对海参的毒性；
3、乐畅药浴后海参腐皮病的恢复效果；
四、实验方案
实验一：桉树精油（乐畅）对盾纤毛虫的影响
1、实验用品：
实验药物：乐畅（主要成份：10％小叶多苞桉精油，山东龙昌动物保健品有限公司）
实验生物：50头/斤越冬海参苗种（大连某苗室），出现纤毛虫感染导致的化皮。
实验器具：烧杯，电子称、移液器、多空凹载玻片、显微镜
2、试验设计：
（1）不同浓度桉树精油对海参组织和水体中盾纤毛虫数量的影响
①实验选择18个烧杯作为实验容器，每个烧杯中放苗种1头（化皮苗种），每3个烧杯作为一个实验浓度组合，实验设一个空白对照组，五个不同梯度实验组。
②实验药物梯度分配：空白对照组（无添加），实验组1（添加160ppm乐畅）、实验组2（添加240ppm乐畅）、实验组3（添加320ppm乐畅）、实验组4（添加400ppm）、实验组5（添加480ppm乐畅）
③药物使用及实验观察方法：实验药品采取药浴方式；
盾纤毛虫数量检测：每30min取一次样，到实验1.5h结束
（2）不同浓度桉树精油对盾纤毛虫活力的影响
①盾纤毛虫活力检测：实验开始加入药物后立即检测一次，后每30min检测一次，到实验1.5h结束。
②实验药物梯度分配：空白对照组（无添加），实验组1（添加160ppm乐畅）、实验组2（添加240ppm乐畅）、实验组3（添加320ppm乐畅）、实验组4（添加400ppm）、实验组5（添加480ppm乐畅），每一组有两个平行实验。
3、测定指标
（1）药浴前后海参体表和水体中盾纤毛虫数量对比：不同时间段观察海参组织盾纤毛虫数量和烧杯底部盾纤毛虫数量的变化，以视野观察平均数作为一次观察的数量。
（2）药浴前后显微镜下观察盾纤毛虫活力情况变化：
+：活力迟缓，10s以上从显微镜视野中央游离出视野
++：活动明显，5-10s从显微镜视野中央游离出视野
+++：活动活跃，3-5s内从显微镜视野中央游离出视野
＋＋＋＋：异常活跃，3s内从显微镜视野中央游离出视野
4、试验结果及分析
表一：不同浓度，不同处理时间盾纤毛虫在组织和水体中的数量变化
表二：不同药物浓度，在相同作用时间的作用效果
结果分析：通过相同作用时间的数量计数发现，随着药物浓度的不断提高，海参组织纤毛虫数量逐渐的下降；同时检测到水体中的盾纤毛虫的数量逐渐增多，盾纤毛虫从组织脱落后进入到水体中。可见桉树精油（乐畅）对盾纤毛虫的驱离作用非常明显。能有效驱赶养殖生物体上的寄生虫。海参药浴时间一般在1-1.5小时，从上述实验可以得出400-480ppm的药物添加量驱离效果更明显。
表三：同一药物浓度，在不同作用时间的作用效果
结果分析：通过不同作用时间的数量计数发现，随着用药时间的延长，海参组织纤毛虫数量逐渐的下降；水体中的盾纤毛虫的数量逐渐增多，说明药物作用时间越长驱虫效果越好，海参药浴时间最好控制在1-1.5小时，这样能充分利用药物，但不宜过长，时间过长会导致海参出现缺氧损伤。
表四：不同浓度，不同处理时间盾纤毛虫活力的变化
结果分析：通过上述表格我们可以看到，未加入桉树精油之前盾纤毛虫的活力正常，加入桉树精油立即在显微镜下检测发现，盾纤毛虫的活力突然提高，运动能力加强，虫体呈现一段兴奋期之后，活力开始逐渐恢复，但是随着药物浓度的增加和时间的推移，虫体的活力开始呈现下降的趋势，特别是400ppm和480ppm浓度下虫体活力变化最大，说明桉树精油已经对盾纤毛虫的生命活动造成影响，并且浓度越大影响越严重。桉树精油可以有效抑制虫体的代谢活动，时间越长抑制效果越明显。
实验二：桉树精油（乐畅）对海参苗种的毒性实验
1、实验用品：
实验药物：乐畅（主要成份：10％小叶多苞桉精油，山东龙昌动物保健品有限公司）
实验生物：50头/斤越冬健康刺参苗种（大连某苗室）
2、实验器具：2L烧杯，电子称
3、试验设计：
（1）实验选择12个烧杯作为实验容器，每个烧杯中放苗种20头健康刺参苗种，每2个烧杯作为一个实验浓度组合，实验设一个空白对照组，五个不同梯度实验组。
（2）实验药物梯度分配：空白对照组（无添加），实验组1（添加160ppm乐畅）、实验组2（添加240ppm乐畅）、实验组3（添加320ppm乐畅）、实验组4（添加400ppm）、实验组5（添加480ppm乐畅）
（3）试验设计及测定分析方法
采用静水试验法， 在2 L的玻璃烧杯中进行，试验期间不投喂饵料，不充氧，水温为 13℃-15℃之间，每隔24 h全量换水1次，换水后将各烧杯中的相关药物浓度调整到原始浓度。分别在12h、24h、48h、72h、96 h记录各组的死亡数和附着在杯壁的个体数。刺参幼参的死亡判断标准是身体自然卷曲，管足及触手收缩回体内，疣刺收缩，无附着、活动及摄食能力，以玻璃棒轻碰之无反应(吕豪等，2005)。实验过程中死亡个体及时从水中移出，防止水质恶化。
表四：不同浓度，不同处理时间对海参活力的变化
结果分析：随着水体中药物浓度的增加， 幼参死亡率随药物浓度升高未出现下降的趋势，整个实验期未出现幼参死亡的现象，说明桉树精油作为一种纯植物提取物安全性是非常高的，对养殖生物的危害较低。幼参的附壁率在实验前期随着药物浓度的加大出现一定变化，浓度越高附壁率越低，但随着实验时间的推移，附壁率逐渐上升，恢复到100%，说明刺参对桉树精油出现一定的应激反应，随着实验进行，海参对这种应激反应逐渐适应，这一点和我们在一线中得到的结果保持一致，未使用过桉树精油的刺参在使用前期会出现一定的反应，比如轻微缩水，附着力下降，摄食降低等现象，但是随着使用次数的增加，这种应激反应会逐渐解除。
五、实验小结
1、毒性试验结果表明，桉树精油对刺参苗种的致死率和附壁率影响不大但幼参的附壁率会随着实验浓度的提高，而出现短时期的下降，随着实验时间的推移，附壁率会逐渐上升。说明刺参对桉树精油出现一定的应激反应，随着实验进行，这种应激反应会逐渐解除。
2、桉树精油对盾纤毛虫的影响表明，随着药物浓度的不断提高和实验时间的延长，海参组织纤毛虫数量出现下降趋势，水体中的盾纤毛虫的数量出现上升趋势，桉树精油（乐畅）对盾纤毛虫的驱离作用非常明显。
3、桉树精油的加入可以导致盾纤毛虫在实验前期出现活力突然提高，运动能力加强，虫体呈现一段兴奋期的现象。但是随着药物浓度的增加和时间的推移，虫体的活力开始呈现下降的趋势，说明桉树精油已经对盾纤毛虫的生命活动造成影响，并且浓度越大影响越严重。桉树精油可以有效抑制虫体的代谢活动，时间越长抑制效果越明显。