青海省位于青藏高原东北部，独特的冷凉性气候孕育了种类丰富、独具特色的药用植物资源，优良的生态环境、日照时间长、紫外线强、昼夜温差大等自然特点为药用植物的生长提供了优势条件。
中药材特别是地道药材种植加工市场前景良好，因地制宜发展中药材产业迫在眉睫。
如今当归、黄芪和藏红花已成为青海省农民脱贫增收的致富药，给我省调整产业结构带来了巨大的经济效益。
在青海省，当归、黄芪、川赤芍、唐古特大黄等在大田种植广泛，而在多数地区采用设施栽培模式种植藏红花。
但每年因当归、黄芪和藏红花根腐病的危害给农户带来不小的经济损失。
有关报道表明引起黄芪根腐病的病原菌主要有腐皮镰刀菌(F.solani)、尖孢镰刀菌(F.oxysporum)、锐顶镰刀菌(F.acuminatum)、芬芳镰刀菌(F.redolens)和木贼镰刀菌(F.equisetim)等。
国内外对黄芪根腐病的防治主要采用化学防治，其中高效低毒杀菌剂是化学防治的首选药剂，如多菌灵、苯醚甲环唑和甲基硫菌灵等。
生物防治方面，在我国已登记的生物农药中尚没有针对黄芪根腐病的生防药剂。
已报道的黄芪根腐病生物防治相关研究，主要处于对土壤微生物和植物内生生防菌株的室内筛选和盆栽试验阶段，效果较好的微生物包括枯草芽孢杆菌和哈茨木霉等，缺乏大规模田间应用的微生物药剂产品。
引起当归根腐病的病原真菌有锐顶镰刀菌(F.acuminatum)、腐皮镰刀菌(F.solani)、尖孢镰刀菌(F.oxysporum)和芬芳镰刀菌(F.redolens)等。
对当归根腐病的防治几乎全部依赖化学农药，针对其病害拮抗微生物的筛选和利用尚处于实验室阶段，离田间生产应用尚有一定距离。
从生态平衡、环境保护、经济节约的角度来看，生物防治是当归根腐病防治的发展趋势，未来当归根腐病有效地防治措施应该是以生物防治为主。
引起藏红花根腐病的病原真菌有尖孢镰刀菌(F.oxysporum)、木贼镰刀菌(F.equisetim)和腐皮镰刀菌(F.solani)等。
目前对于藏红花根腐病的防治在实际生产中依然多用化学防治方法。
然而长期使用化学农药会对环境及生态系统产生不良影响，并影响与植物相关的有益微生物区系，同时存在病原菌耐药性的问题。
本团队前期明确青海省部分地区当归、黄芪和藏红花根腐病病原菌，筛选得到防治病害的若干高效、低毒化学杀菌剂。
但是，目前对青海省当归、黄芪和藏红花根腐病生物药剂的筛选研究还鲜有报道。
本研究旨在筛选高效、绿色、无污染的生物防治药剂用于防治当归、黄芪和藏红花根腐病，为后续开展药用植物根腐病大田绿色防控提供基础。
供试病原菌均由青海大学农牧学院植物保护实验室分离、鉴定和保藏。
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菌株编号 |
采集地 |
病原 |
病害 |
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DG-2 |
青海省海东市民和县马营镇洒达庄村 |
粉红螺旋聚孢霉(Clonostachysrosea) |
当归根腐病 |
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DG-3-1 |
青海省海东市民和县马营镇洒达庄村 |
锐顶镰刀菌(Fusarium acuminatum) |
当归根腐病 |
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HQ-2-1 |
青海省海东市民和县马营镇洒达庄村 |
腐皮镰刀菌(F.soani) |
黄芪根腐病 |
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HQ-5-1 |
青海省海东市民和县马营镇洒达庄村 |
木贼镰刀菌(F.equiseti) |
黄芪根腐病 |
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HQ-8-1 |
青海省海东市民和县马营镇洒达庄村 |
逗号镰刀菌(F.virguliforme) |
黄芪根腐病 |
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ZHH-1 |
青海省西宁市城北区二十里铺玛可河林业局苗木培育基地 |
尖孢镰刀菌(F.oxysporum) |
藏红花根腐病 |
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ZHH-WZW-2 |
青海省西宁市城北区二十里铺玛可河林业局苗木培育基地 |
木贼镰刀菌(F.equiseti) |
藏红花根腐病 |
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药剂名称 |
生产厂家 |
浓度梯度(mg/L)或稀释倍数(倍) |
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1.8%阿维菌素乳油 |
河北省农药化工有限公司 |
0.005625、0.01125、0.0225、0.045、0.09、0.135 |
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2%苦参碱水剂 |
河北安格诺农化有限公司 |
0.0075、0.01、0.015、0.025、0.05、0.075、0.1 |
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3亿CFU/g哈茨木霉菌可湿性粉剂 |
美国拜沃股份有限公司 |
100、300、600、1000 |
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50亿CFU/g多粘类芽孢杆菌可湿性粉剂 |
山西省临猗中晋化工有限公司 |
100、300、600、1000 |
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100亿CFU/g解淀粉芽孢杆菌可湿性粉剂 |
杨凌绿都生物科技有限公司 |
100、300、600、1000 |
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2亿CFU/g细黄链霉菌可湿性粉剂 |
河南好美特生物科技有限公司 |
100、300、600、1000 |
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1000亿CFU/g枯草芽孢杆菌可湿性粉剂 |
河北中保绿农作物科技有限公司 |
100、300、600、1000 |
前期采用滤纸片保存法保藏病原菌。
在超净工作台中将单个纸片接种到PDA培养皿中央进行活化，在25℃培养箱中培养7d，用于后续试验。
采用菌丝生长抑制法。
根据仿生物提取物类杀菌剂的有效成分含量计算出药剂浓度，药剂原液即为母液。
使用时，按照不同浓度的要求吸取相应量母液，混于PDA培养基后倒平板，且厚度一致，每个浓度重复3次。
以不加药剂的培养基为对照组。
用直径为0.5cm的无菌打孔器在各菌菌落边缘打孔，再将打好孔的菌饼接到含药平板中央，放置于25℃的培养箱中培养7d，用十字交叉法测量含药培养基中菌落生长的直径与对照组的菌落直径，根据两者之间的差值判断该种药剂在不同浓度对该菌株的抑制作用。
使用SPSS、EXCEL数据处理软件，求得b值±标准误差、抑制中浓度(EC50)、95%置信限、卡方值和P值。
采用对峙培养法。
用分析天平准确称取拮抗菌类抑菌剂药品于无菌试管中，按照稀释100倍、300倍、600倍、1000倍的要求加入一定量体积的无菌水混合均匀，制成母液备用。
使用时，用移液枪吸取10μL配置好的拮抗菌类抑菌剂母液，然后接到平板的一侧。
用直径为0.5cm的无菌打孔器在各菌菌落边缘打孔，再将打好孔的菌饼接到平板另一侧与供试药品相对应的位置，每个稀释倍数重复3次，放置于25℃的培养箱中培养7d，测量抑菌带，根据抑菌带的大小判断该种药剂在不同浓度对该菌株的抑制作用。
试验共7个处理，3次重复。
小区面积66.6m2，于2022年5月初在青海省湟中区进行当归根腐病大田防治效果试验。
以清水作为对照，10月初调查统计当归根腐病的发生情况，通过计算病情指数和防治效果判断药剂的防治效果。
在前期当归根腐病化学药剂室内筛选的基础上(数据未发表)，选用25%硅唑·咪鲜胺以及本研究防治效果最好的5种生物药剂。
浸根时间为45min;拌土时将取好的药剂加入0.5kg的土中充分混合，然后均匀撒到种植小区内再种植当归。
1.8%阿维菌素乳油对7种病原菌具有很强的抑制作用，EC50值在0.004～0.065mg/L之间。
2%苦参碱水剂对ZHH-1(尖孢镰刀菌)的抑制作用最强，EC50值为0.063mg/L，其次是对ZHH-WZW-2(木贼镰刀菌)，EC50值为0.932mg/L，对于其余几种病原菌虽有抑制作用但效果不是很好，EC50值在1.283～2.036mg/L之间。
解淀粉芽孢杆菌可湿性粉剂的抑制作用最好，稀释100倍液时对当归根腐病菌DG-2、DG-3-1和黄芪根腐病菌HQ-2-1的抑菌带宽度分别为2.23cm、2.27cm和2.57cm。
对藏红花根腐病菌ZHH-WZW-2的抑菌效果最差，稀释100倍液时抑菌带宽度仅为0.97cm。
随着稀释倍数的增加对7株病原菌的抑菌带逐渐减小。
哈茨木霉菌可湿性粉剂抑菌效果也较好，稀释100倍液时对当归根腐病菌DG-2、DG-3-1和黄芪根腐病菌HQ-2-1的抑菌带宽度分别为1.73cm、2.13cm和1.63cm;稀释300倍液时对这3株病原菌的抑菌带宽度分别为1.63cm、1.85cm和1.50cm。
50亿CFU/g多粘类芽孢杆菌可湿性粉剂抑菌效果也较好，稀释100倍液时对DG-3-1、HQ-2-1和HQ-8-1的抑菌带宽度分别为1.87cm、2.00cm和1.87cm。
细黄链霉菌可湿性粉剂和枯草芽孢杆菌可湿性粉剂对7种病原菌的抑制作用一般，稀释100倍液时抑菌带宽度都小于2cm。
稀释100倍液的细黄链霉菌对DG-3-1和HQ-2-1的抑制效果最好，抑菌带宽度分别为1.77cm和1.60cm;对ZHH-1的抑制作用最差，抑菌带宽度为0.50cm。
稀释100倍液枯草芽孢杆菌对HQ-2-1和HQ-5-1的抑制效果最好，抑菌带宽度分别为1.77cm和1.80cm。
对HQ-8-1的抑制效果最差，抑菌带宽度仅为0.67cm。
5种生物制剂对当归根腐病大田防治效果不同。
2022年10月初经过调查发现，除去抽薹植株和发病植株，田间健康当归数量对照组仅为100株。
解淀粉芽孢杆菌对当归根腐病的防治效果较好，10月初健康植株数为179株，病情指数为18.22，防治效果为66.97%。
但是没有化学药剂25%硅唑.咪鲜胺对当归根腐病防治效果好，其10月初健康植株数为190株，病情指数为14.80，防治效果为73.17%。
苦参碱、阿维菌素、多粘类芽孢杆菌和哈茨木霉防治效果较差，防治效果均低于50%。
2019年青海省确定了《全省实施化肥农药减量增效行动总体思路和2019年试点方案》，从2019年起到2023年，青海省全省内种植业基本实现从数量型向质量型转变，全面构建以绿色为导向的农业技术体系。
其中，2019年全省实施有机肥替代化肥及农作物病虫害绿色防控技术试点面积76000hm2。
鉴于青海省的生态保护价值和意义，以及化肥农药减量使用政策的实施，在这种情势下寻找适用于青海高寒地区低残留、对环境友好、高效的生防药剂减少化学农药的使用是一条很好的出路，既能保护生态环境又能使农民持续耕作。
既符合我省“生态立省”战略，又能减少农药的使用，减轻农药的“抗药性、再猖獗、农药残留”问题，以此充分发挥我省的环境优势，发展生态中药材。
本研究通过病原菌对不同杀菌剂的敏感性测定，发现仿生物提取物类杀菌剂阿维菌素和苦参碱，拮抗菌类抑菌剂解淀粉芽孢杆菌、多粘类芽孢杆菌和哈茨木霉菌对根腐病病原菌的室内抑制效果较好。
木霉菌、芽孢杆菌和链霉菌都是常见的农用杀菌剂，通过竞争或拮抗作用等保护植物免受病原菌侵染。
滕艳萍等研究发现木霉菌可以有效缓解黄芪根腐病的发生，与本试验所得结果一致。
赵晓霞等的研究表明芽孢杆菌对黄芪根腐病病原菌的抑制效果明显，其中枯草芽孢杆菌效果最为显著。
当归根腐病的大田试验结果表明，化学药剂25%硅唑·咪鲜胺、生物药剂解淀粉芽孢杆菌在防治当归根腐病方面具有良好的预防和控制作用。
因此，后续可以使用高效、低毒化学药剂和绿色、安全生物药剂相结合的方法进行当归根腐病综合防治。
阿维菌素是链霉菌的次生代谢产物，常用于杀虫、杀螨和杀线虫；苦参碱是一种天然植物性农药，对多种作物上的害虫都具有较好的防效。
本研究表明阿维菌素和苦参碱在室内抑菌效果良好，但是大田试验时发现防治效果只有24.39%和18.70%，由此推断，大田环境复杂多变对生物农药的抑制效果会产生较大影响。
综上所述，本研究初步筛选得到防治当归、黄芪和藏红花根腐病的生防制剂，为青海省药用植物根腐病生物防治提供参考和依据。
研究结果为日后大田防治当归、黄芪和藏红花根腐病提供备选药剂，同时也为生物农药在大田的轮换使用提供参考。
后续我们将继续对中药材根腐病菌多样性及综合防治方法进行研究。