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阪崎肠杆菌(Enterobacter sakazakii)是一种革兰氏阴性的杆状细菌,又被称为阪崎克罗诺杆菌,是常见的食源性条件致病菌,容易污染牛奶和婴幼儿奶粉。

阪崎肠杆菌可引起所有年龄段人群感染,其中婴幼儿为高危人群,容易引起婴幼儿脑膜炎、菌血症和坏死性小肠结肠炎等多种疾病。

近年来,阪崎肠杆菌污染事件频繁发生,阪崎肠杆菌污染婴儿配方奶粉的潜在风险已成为制造商、监管机构和消费者所面临的重要问题。

目前多用于控制婴幼儿配方奶粉或其他食品中阪崎肠杆菌的物理方法有脉冲强光辐照、巴氏杀菌、紫外辐射等,但物理方法会对婴儿食品中的敏感营养成分造成一定的损失,并且设备成本较高。

也有学者研究了植物提取物和其他化学物质可抑制阪崎肠杆菌,发现丁香酚、柠檬醛、反式肉桂醛、氯化铁等铁盐、忧遁草提取物、水溶性麝香种子提取物等都对阪崎肠杆菌具有明显的抑菌活性。

但这些化学抑菌方法来源多样,还需验证抑菌机制并进行安全性评估。

随着生活水平的日益提高,人们愈加关注食品健康问题,对健康有效、绿色安全的食品需求不断增加。

安全性能高、化学性质稳定的益生菌代谢产物愈发受到研究者的青睐,具有广谱抑菌效果的乳酸菌细菌素逐渐成为食品添加剂防控、药物制剂研发方面的热点。

肠道菌群是宿主鱼类的重要组成成分。

鱼体肠道内的乳酸菌可通过产酸或细菌素以抑制有害菌生长,对鱼类肠道菌群平衡具有重要作用。

大弹涂鱼的肠道菌群多样性丰富,有乳酸菌的存在。

乳酸菌属为酸菜中的优势菌属,有学者从酸菜发酵液中分离出了植物乳杆菌、副干酪乳杆菌、副布氏乳杆菌等乳酸菌。

袁先铃等从酸菜中分离得到的乳酸菌所产细菌素可抑制大肠杆菌、沙门氏菌和金黄色葡萄球菌。

乳酸菌除了产生有机酸和过氧化氢之外,还产生具有抑菌活性的蛋白质类物质—细菌素。

乳酸菌细菌素具有抑菌活性好、安全性高且来源丰富等特点,应用于食品工业中可以有效减少化学防腐剂的使用量,具有广阔应用前景。

筛选抗氧化性能与天然抗氧化剂能力相当的益生乳酸菌对开发功能性的食品、食品防腐有重要的研究意义。

如唾液乳杆菌、植物乳杆菌、副干酪乳杆菌等多种乳酸菌的发酵产物常具有良好的抑菌效果。

尹杨燕等发现鸡肠道来源的植物乳杆菌,其产物可以抑制大肠杆菌和沙门氏菌。

倪敬轩等发现猪肠道来源的一株嗜酸乳杆菌,其产物可抑制大肠埃希氏菌。

我国乳酸菌来源广泛,菌种资源丰富,研究乳酸菌所产抗菌物质对致病菌的应用具有广阔的前景。

目前,国内成型的细菌素类产品较少,仅有乳酸链球菌素(Nisin)和片球菌素(Pediocin PA-1)两种。

因此研发乳酸菌细菌素类制剂,探究其作为天然抑菌剂、防腐剂在奶制品中控制阪崎肠杆菌的潜力,对于当前我国的天然抑菌剂研究至关重要,也是今后抗菌剂研发的重要发展方向。

本研究以阪崎肠杆菌为指示菌,从市售酸菜和大弹涂鱼肠道中筛选具有产抑菌物质的乳酸菌菌株并对其进行鉴定，以及抑菌物质特性和抑菌机制研究,为其作为生物防腐剂在奶制品中的应用提供理论依据。

材料与方法

材料与试剂

菌株来源于市售农家酸菜和大弹涂鱼肠道。

酸菜取自宁波多家农贸市场售卖酸菜及酸菜水。

健康大弹涂鱼,体重30～40 g/尾,购自浙江省宁波市路林市场。

阪崎肠杆菌Enterobacter sakazakii (CICC221543)、大肠埃希氏菌Escherichia coli (ATCC25922)、鼠伤寒沙门氏菌Salmonella typhimurium (CICC22956)、单核细胞李斯特氏菌Listeria monocytogenes (ATCC19115)、金黄色葡萄球菌Staphylococcus aureus (ATCC25923)、蜡样芽孢杆菌Bacillus cereus (ATCC11778)、白色念珠菌Monilia albican(ATCC10231),由浙江万里学院微生物实验室保存。

琼脂、MRS培养基、LB培养基(生化试剂,青岛海博生物技术有限公司);引物227F A5'-AGAGTTTGATCMT GGCTCAG-3')、1492R (5'-TACGGYTACCTTGTTACGA CTT-3')(北京*合六**华大基因科技有限公司);磷酸盐缓冲溶液(phosphate buffered solution,PBS)(分析纯,北京酷来搏科技有限公司);*酮丙**、乙酸乙酯、甲醇(分析纯,国药集团化学试剂有限公司)。

仪器与设备

QL-861涡旋仪(海门市其林贝尔仪器制造有限公司);ZHWY-2112B大容量全温度恒温培养振荡箱(金坛市盛蓝仪器制造有限公司);AG 22331 Hamburg PCR仪(德国艾本德公司);MμLtiskan FC酶标仪(美国赛默飞世尔科技公司);721G可见分光光度计(上海菁华科技仪器有限公司);ALPHA 1-2 LD冷冻真空干燥机(北京博劢行仪器有限公司);Nikon 80i荧光显微镜(日本尼康公司);SW-CJ-1 F超净工作台、YXQ-75SII立式压力蒸汽灭菌锅(上海博迅实业有限公司)。

实验方法

乳酸菌的分离纯化

参照顾彬涛的方法,在无菌条件下抽取25 m L收集的酸菜水试样放入50 m L离心管中,加入25 m L无菌生理盐水,涡旋振荡20 min,再进行10倍梯度稀释。

选择合适的稀释梯度接种含1.0%Ca CO3的MRS固体培养基,37℃培养24 h。

选取有溶解圈的典型菌落,挑取菌落平板划线接种3代,置于4℃保存备用。

取市售大弹涂鱼,以无菌解剖刀破坏大弹涂鱼脑部细胞待其死亡后,从肛门处划开大弹涂鱼肠道,收集每条鱼的肠及其内容物,放于无菌10 m L离心管中,加入5 m L无菌水,涡旋振荡2 min,稀释100倍后涂布于含1.0%Ca CO3的MRS固体培养基。

37℃培养24 h,挑取有溶解圈的典型菌落,挑取单菌落平板划线接种3代,置于4℃保存备用。

产广谱抑菌物质乳酸菌的筛选

无细胞上清液的制备:挑取乳酸菌株单菌落接种于5 m L MRS液体培养基中,在37℃培养36 h,取培养液4℃8000 r/min离心10 min,收集上清液以10 m L注射器安装0.22μm孔径水相滤膜进行除菌,即得到无细胞发酵上清液(cell free supernatants,CFS),置于4℃备用。

指示菌悬液的制备;挑取指示菌单菌落接入LB液体培养基中,37℃、100 r/min摇床培养16 h后,以无菌水将菌液梯度稀释至浓度1.0×107 CFU/m L,置于室温保存待用。

配制100 m L的LB,固体培养液,灭菌待冷却至50℃左右时,然后倾倒平板备用。

参考琼脂平板扩散法筛选具有抑菌活性的乳酸菌。

用无菌水将E.sakazakii菌液浓度调OD600 nm约等于0.630,菌液含量为1.5×107 CFU/m L,取150μL菌液涂布于固体LB培养基,放置牛津杯,在牛津杯中加入200μL分离乳酸菌的无细胞上清液,37℃培养16 h后以游标卡尺测定抑菌圈大小。

选择抑菌圈直径大于10 mm(牛津杯直径8.5 mm)的乳酸菌进行复筛。

乳酸菌代谢产生的过氧化氢也可以抑制细菌的生长,并应用于食品包装防腐,将上清液以1 mol/L Na OH溶液和0.1 mol HCl溶液分别调整p H到6.5,以1.5×107 CFU/m L的阪崎肠杆菌做指示菌,进行牛津杯抑菌实验。

将过氧化氢酶溶解并按照最终质量浓度为1 mg/m L加入到上清液中,37℃水浴处理2 h沸水煮沸5 min使酶灭活,进行后续实验。

分离乳酸菌种属的鉴定

形态学鉴定:挑取目标菌株单菌落接种于MRS固体培养基,于37℃下培养24 h,观察其在固体培养基上的菌落形态,并对菌株进行革兰氏染色,在显微镜下观察菌体形态。

取液体培养16 h的菌液,离心后去除培养基,以无菌水做载体,对发酵黏液乳杆菌进行扫描电镜观察,以扫描电镜观察具有显著抑菌效果的乳酸菌菌体形态。

生理生化鉴定:根据《常见细菌系统鉴定手册》和《乳酸细菌分类鉴定及实验方法》中描述的特征进行分析鉴定。

反应结果阳性用(+)表示,阴性用(-)表示,对目标菌株的菌属做初步鉴定。

16S r DNA序列分析:将乳酸菌接种于6 m L MRS液体培养基中,37℃100 r/min培养24 h,10000 r/min离心2 min,弃上清,加入500μL无菌水混匀,加入终质量浓度为20.0 mg/m L的溶菌酶,参照Omega离心柱型细菌基因组DNA提取试剂盒提取乳酸菌菌株DNA。

以提取出的DNA为模板,27F (5'-AGAGTTTGATCMTGGCTCAG-3')和1492R (5'-TACGGYTACCTTGTTACGACTT-3')为引物,扩增乳酸菌16S r DNA基因。

PCR扩增体系(25μL):2×Flash Hot Start Master Mix 12.5μL;上下游引物各1μL;模板2μL;补dd H2O至25μL。

PCR反应程序:95℃预变性5 min;95℃变性30 s,55℃退火30 s,72℃延伸90 s,共30个循环;72℃延伸10 min,4℃保存。

以1.0%琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物,切胶回收目的条带,具体参照琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒说明书。

PCR产物送样杭州华大基因鉴定公司测定目的基因序列。

将得到的基因序列通过BLAST在Gen Bank中进行同源比对,初步确定拮抗菌种属,采用MEGA 6.0软件构建系统发育树。

乳酸菌发酵液抑菌活性的测定

(1)乳酸菌生长曲线测定

以酶标仪法测定不同组别的OD600 nm值。

将菌株活化后,以2%的接种量接种于1 L MRS液体培养基中,于52 h内取样,每隔4 h取样5 m L,取上清液测定OD600 nm、p H。

(2)乳酸菌抑菌物质产生曲线

测定24 h内抑菌物质的产生曲线:取32 h内每2 h的发酵上清液,于96孔板中加入以下成分,90μL LB培养基、10μL发酵上清液、10μL 1.5×107 CFU/m L E.sakazakii菌液。

在37℃条件下静置培养,在培养时间24 h内每2 h测定OD600 nm吸光度,记录数据。

(3)乳酸菌发酵液的杀菌时间曲线

参考徐艳阳等的方法测定杀菌时间曲线。

取2 m L培养36 h的发酵上清液添加至5 m L 1×106 CFU/m L培养16 h的阪崎肠杆菌悬液中,对照组为2 m L无菌水添加到5 m L 1×106 CFU/m L培养16 h的阪崎肠杆菌悬液,置于37℃培养,分别于0、10、20、30、40、50、60、70 min时取样,涂布于普通营养琼脂培养基上,置于37℃培养24 h,计算菌落数。

乳酸菌发酵液的特性测定

(1)乳酸菌发酵液的蛋白酶稳定性

配制胰蛋白酶(2500 U/mg)、α凝乳蛋白酶(1000 U/mg)和蛋白酶K (30 U/mg),各种酶的酶溶液5 mg/m L,取1 m L各个酶溶液置于10 m L离心管中。

将发酵黏液乳杆菌上清液p H调整至与各酶的最适p H相等,取2 m L上清液分别加入对应好的10 m L含有1×107 CFU/m L阪崎肠杆菌的离心管中,在37℃条件下水浴4 h后,取出放入100℃水浴中处理5 min,使酶失去活性。

另取1 m L各个酶溶液加入到相同浓度相同体积的阪崎肠杆菌中作为对照组1,取未添加酶处理的上清液作为对照组2。

抑菌率计算公式见式(1):

式(1)中,A1为CFS抑菌直径,A2为发酵液酶解后抑菌圈直径。

(2)乳酸菌发酵液的热稳定性

分别取10 m L上清液放于7根试管中。

置于50、60、70、80、90、100、121℃条件下热处理20 min,121℃采用高压灭菌锅进行处理。

待冷却至室温,以未经处理的发酵上清原液作为对照进行抑菌实验,观察温度对产细菌素抑菌活性的影响。

(3)乳酸菌抑菌谱的测定

将指示菌大肠埃希氏菌、鼠伤寒沙门氏菌、单核细胞李斯特氏菌、金黄色葡萄球菌、蜡样芽孢杆菌、白色念珠菌活化3代后,取菌液进行梯度稀释调节至107 CFU/m L,取发酵上清液进行抑菌实验。

1.3.6 乳酸菌抑菌物质的提取与抑菌活性检测

采取有机试剂萃取法提取抗菌粗提物,取60 m L发酵黏液乳杆菌SA35上清液以50℃,20 r/min的转速进行旋蒸,浓缩至20 m L时取出备用,向20 m L浓缩发酵液中加入20 m L乙酸乙酯(1:1,V:V),进行涡旋振荡混匀2 h,将混合液体置于分液漏斗中,静置过夜,取出有机相,继续旋蒸,直至无乙酸乙酯残留。

取乙酸乙酯萃取液200μL与发酵上清液200μL进行牛津杯抑菌实验,观察细菌素是否被提取成功。

将乙酸乙酯萃取液进行冷冻真空干燥,冻干至粉末,称重记录。

将200µg*干粉冻**末用2 m L无菌水溶解后经0.22µm滤膜过滤,得到100µg/m L的细菌素粗提液。

将160μL1.0×107 CFU/m L阪崎肠杆菌涂布在LB培养基平板上,放置牛津杯,加入200μL抗菌粗提物,实验平行3次,以乙酸乙酯做阳性对照平行实验3次。

正丁醇与乙醇的提取方法与乙酸乙酯的处理方法一致。

乳酸菌发酵液抗菌物质抑菌机制初探

取200μL活化好的阪崎肠杆菌,4000 r/min离心10 min,弃上清,以1 m L无菌水进行复溶,混匀备用。

取200μL混匀的菌液,加入抗菌粗提物200μL,置于37℃培养60 min。

将阪崎肠杆菌菌液与抗菌物质反应后的菌液进行电子显微镜观察菌体形态。

以2.5%的戊二醛溶液固定阪崎肠杆菌于4℃过夜。

用乙醇溶液脱水后再用无水乙醇和*酮丙**处理20 min(1:1,V:V),用*酮丙**和包埋液的混合浓度(3:1,V:V),分别处理样品1 h和3 h。

包埋剂70℃加热过夜,包埋得到样品,样品超薄切片后经醋酸双氧铀50%乙醇饱和溶液和柠檬酸铅溶液各染色5～10 min,在透射电子显微镜下观察,采集图像。

数据处理

采用Microsoft Excel 2008软件及Graph Pad Prism8软件对数据进行分析处理,绘制表格,方法中每个实验重复3次,数据用平均值±标准差表示,用软件SPSS 25进行数据分析。

通过使用Graph Pad Prism 8.0软件单因素方差分析(one-way analysis of variance,ANOVA)确定统计显著性,P<0.05被认为具有显著差异。

GONZALE-SILES L,KARLSSON R,SCHMIDTT P,et al.A pangenome approach for discerning species-unique gene markers for identifications of Streptococcus pneumoniae and Streptococcus pseudopneumoniae[J].Front Cell Infect Microbiol,2020,(10):222.

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