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类风湿性关节炎（RA）是一种慢性炎症性疾病，会导致关节软骨和骨骼退化。Toll样受体4（TLR4）已被确定为RA相关炎症的关键因素。虽然Toll样受体拮抗肽2（TAP2）具有作为抗炎剂的潜力，但其体内降解率阻碍了其疗效。
近日，来自 韩国亚洲大学的Sangdun Choi和Moon Suk Kim团队 设计了包裹TAP2的点击交联透明质酸水凝胶（TAP2+Cx-HA）用于关节内给药，旨在增强TAP2作为关节腔内抗炎剂的有效性 。研究结果表明，TAP2+Cx-HA可以作为RA的有效关节内治疗，既能缓解症状，又能促进软骨再生（图1）。这种创新的输送系统在改善类风湿性关节炎和其他炎症性关节疾病的管理方面具有重大前景。
相关论文 “Enhanced intra-articular therapy for rheumatoid arthritis using click-crosslinked hyaluronic acid hydrogels loaded with toll-like receptor antagonizing peptides” 于2023年10月21日在线发表于杂志 《Acta Biomaterialia》 上。
图1 使用TAP2负载的Cx-HA水凝胶治疗类风湿性关节炎的示意图
1. 注射制剂的制备和表征
根据之前的研究制备了TE-HA和TC-HA，然后分别将其与TAP2和HA混合，得到TAP2+TE-HA和TAP2+TC-HA。流变学评估说明，与TAP2+HA相比，TAP2+Cx-HA具有明显更坚硬的质地和类似水凝胶的特性。SEM表明TE和TC在HA上的点击交联产生了三维多孔结构。注射性测试表明，所得的 TAP2+Cx-HA水凝胶表现出类似水凝胶的特征和相互关联的形貌 （图2）。并在之后的实验中使用26-G针头进行体内关节内注射。
图2 注射制剂的制备和表征
2. TAP2（单个或重复）或TAP2+Cx-HA水凝胶的体外细胞活力和抗炎能力
细胞实验显示TAP2和Cx-HA不会对滑膜或RAW 264.7细胞的活力产生不利影响（图3a-b）。炎症测试实验表明， TAP2+Cx-HA处理对RAW 264.7细胞具有抗炎作用，这是培养基中TAP2+Cx-HA复合物持续释放TAP2的结果 （图3c-d）。RT-PCR定量了来自RAW 264.7细胞的血液中促炎细胞因子（TNF-α和IL-6）和抗炎细胞因子IL-10的相对基因表达（图3f-h）。 ELISA检测中TNF-α、IL-6和IL-10的相对基因表达模式与所有治疗组的PCR模式非常相似。
图3 生物相容性和抗炎能力评估
3. HA-NIR和Cx-HA-NIR水凝胶的体内保留
采用NIR荧光实时成像技术，研究者评估了HA-NIR和Cx-HA-NIR水凝胶的体内保留（图4）。这些制备的制剂通过关节内注射到RA受影响的大鼠的膝关节中单独施用。在注射FI-TAP2+HA-NIR后，在注射后的第一天观察到归因于FI-TAP2的鲜艳绿色荧光，归因于HA-NIR的强烈红色荧光，以及由绿色和红色信号叠加产生的复合黄色荧光。观察结果表明， HA-NIR可作为FI-TAP2的瞬时储存库 ，其在关节内注射部位的快速下降证明了这一点。
图4 HA-NIR和Cx-HA-NIR水凝胶的体内保留
4. 体内评估
为了研究TAP2给药在RA缓解中的治疗效果，将不同制剂的TAP2（单剂量或重复给药）或TAP2+Cx-HA通过关节内给药到诱导RA鼠的膝关节中。对这些动物进行为期6周的监测（图5）。结果表明，与其他制剂相比，T AP2+Cx-HA在缓解炎症症状方面更有效 ，从而在RA大鼠模型中取得了显着的治疗效果。
图5 基于踝关节直径、AI和爪子成像的RA逆转评估
为了评估治疗对软骨组织的潜在治疗效果，对关节内注射的RA大鼠的关节膝关节组织进行SO染色（图6）。SO染色后，膝关节中的GAG沉积物表现为棕色区域。 TAP2+Cx-HA处理的RA大鼠的软骨图像中存在圆形空隙，表明新软骨组织形成的开始。
图6 组织学染色评估
采用三维显微CT评估RA大鼠关节内注射TAP2-single、TAP2-repeat和TAP2+Cx-HA1、3和6周后关节内新骨组织的生成情况（图7）。与其他治疗相比， TAP2-repeat和TAP2+Cx-HA方案显着增强了膝关节关节的新骨形成 。
图7 显微CT评估
在对关节膝关节进行TNF-α免疫组织化学染色后，对红色阳性区域进行定量，以评估RA患者大鼠的TNF-α表达（图8）。用TAP2+Cx-HA处理的RA大鼠的显微照片在1周时显示红色染色区域，3周时显着减少。到第六周，没有可见的红色染色，组织与正常大鼠的组织非常相似， 表明TNF-α表达得到有效抑制 。
图8
综上，本文证实了以下假设：当通过关节内注射给药时，TAP2+Cx-HA可在关节内长时间维持TAP2的治疗水平，而不会产生显着的脱靶效应。 含有TAP2制剂的直接关节内递送提供了一种可行的策略，通过延长受影响关节对TAP2的暴露时间，为逆转RA的临床前和临床阶段提供了一种可行的策略，从而最大限度地减少对其他器官或组织的不良全身影响。
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