编译：微科盟 Biomaker，编辑：微科盟 景行、江舜尧。
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导读
重金属污染对人类健康构成重大威胁，对农业生产力造成严重破坏。植物修复是一种以植物为基础、对环境无害且具有成本效益的方法，用于从污染土壤中去除重金属，特别是在农业或重金属敏感的土地上。然而，不同植物种类和种质资源的植物修复能力表现出显著的遗传多样性，而这些差异背后的机制迄今尚不清楚。鉴于其潜在的益处，植物的遗传改良对于提高它们对重金属的吸收、对有害水平的耐受性以及在受污染土壤中的整体生长和发育至关重要。 在本研究中，研究者发现了一个调控棉花镉（Cd2+）耐受性的分子级联，涉及GhRCD1、GhbHLH12、GhMYB44和GhHMA1。研究者鉴定了一种Cd2+敏感的棉花T-DNA插入突变体，其 GhRCD1 表达受到破坏。 通过CRISPR/Cas9技术基因 敲除 GhRCD1 导致棉苗Cd2+耐受性降低，而 GhRCD1 过表达则增强Cd2+耐受性。研究者通过分子相互作用分析证明，为了响应Cd2+的存在，GhRCD1直接与GhbHLH12相互作用。这种相互作用会激活GhMYB44，随后GhMYB44通过直接与其启动子中的G-box顺式元件结合来激活重金属转运蛋白 GhHMA1 。这些发现为负责棉花中Cd2+耐受性的新型GhRCD1-GhbHLH12-GhMYB44-GhHMA1调控模块提供了重要见解。 此外，本研究还阐明了棉花耐Cd2+遗传调控的分子机制，为棉花耐Cd2+优良品种的培育奠定了基础。
论文ID
原名： GhRCD1 promotes cotton tolerance to cadmium by regulating the GhbHLH12-GhMYB44-GhHMA1 transcriptional cascade
译名： GhRCD1通过调控GhbHLH12-GhMYB44-GhHMA1转录级联促进棉花对镉的耐受性
期刊： Plant Biotechnology Journal
IF： 13.8
发表时间： 2024年2月
通讯作者： 葛晓阳、李付广，赵航，段红英
通讯作者单位： 中国农业科学院棉花研究所，曲阜师范大学，河南师范大学
DOI号： 10.1111/pbi.14301
实验设计
结果
1 rcd1突变可降低陆地棉对Cd2+的抗性
研究者经过50μM CdCl2水培的广泛筛选，分离出一个Cd2+敏感表型的突变体，能够用来探究棉花对Cd2+毒性不同反应的分子机制。 侧翼序列检查结果显示，T-DNA已被引入GhRCD1基因的上游，这可能会影响其表达（图1a）。因此，它被称为rcd1，其中通过Southern blotting检测到T-DNA的单个拷贝（图1b）。RT-qPCR分析显示，与对照组相比， GhRCD1 的表达水平显著降低（图1c）。
ZM24野生型（WT）和 ghrcd1 幼苗的形态学比较表明， ghrcd1 幼苗对Cd2+的耐受性低于WT植株 ；茎尖分生组织（SAM）、根、茎和叶组织发生更广泛的坏死，并且经过25天的Cd2+处理后， ghrcd1 幼苗的侧根数量显著减少（图1d，e）。同时，经Cd2+处理后， ghrcd1 幼苗的细胞死亡率明显高于ZM24，如PI染色所示（图1f，g）。此外，与Cd2+处理后的WT对照植物相比， ghrcd1 幼苗中叶绿体超微结构发生明显畸变（图1h），这与在Cd2+处理25天后，与WTZM24植物相比，在 ghrcd1 幼苗中观察到的土壤植物分析发育（SPAD）值降低一致（图1i）。 综上所述，这些结果共同表明，破坏 GhRCD1 可以降低Cd2+耐受性，表明 GhRCD1 可能是镉胁迫的一种新的正调节因子。
图1. ghrcd1 突变体降低Cd2+抗性。 （a）T-DNA插入突变体 ghrcd1 的结构图。（b） ghrcd1 的DNA印迹分析。M，标记。 ghrcd1 ，T-DNA插入突变体。（c） GhRCD1 在ZM24和 GhRCD1 中的相对表达量。GhUBQ7用作内参对照。（d）经水或Cd2+处理的 ghrcd1 株系表型。比例尺:1cm。（e）用CdCl2或水处理后ZM24和 ghrcd1 的侧根数量。（f）PI染色表明用水或CdCl2处理的ZM24和 ghrcd1 的细胞死亡。比例尺：15μm。（g）Cd2+处理后ZM24和 ghrcd1 植株不同程度坏死细胞的百分比。I，仅活细胞的细胞壁被染色。II，轻微损伤的细胞，细胞壁和细胞核均被染色。III，严重受损的细胞，只有死细胞的细胞核被染色，看不到完整的细胞轮廓。（h）50μM Cd2+处理后ZM24和 ghrcd1 叶片细胞叶绿体结构的显微照片。比例尺：0.5μm。（i）50μM CdCl2处理后ZM24和 ghrcd1 的SPAD值。采用水处理作为空白对照。在（d-i）中，将14d的LD生长的植物用水或50μM CdCl2处理25天。数值表示平均SD（n=15）。* P ＜0.05；** P ＜0.01；*** P ＜0.001。
2 棉花 ghrcd1 基因敲除突变体对Cd2+的耐受性降低
为了进一步研究 GhRCD1 在棉花抗Cd2+胁迫中的作用，研究者使用CRISPR/-Cas9系统构建了GhRCD1A/D（Gh_A08G1390/Gh_D08G1685）双敲除（KO）棉花株系 ，其中表达了两个靶向外显子1的sgRNA由pKSE401-2sgRNA载体（图S1a，b）。 研究者选择3个rcd1纯合子双突变系进行进一步鉴定 ，包括 KO-GhRCD1#35 ，其在由sgRNA1介导的 GhRCD1-At 和 GhRCD1-Dt 中分别携带6-nt和5-nt缺失（sg1-Atd6d6Dtd5d5）； KO-GhRCD1#86 ，其在由sgRNA1介导的 GhRCD1-At 和 GhRCD1-Dt 中均携带1-nt缺失，以及分别在由sgRNA2介导的 GhRCD1-At 和 GhRCD1-Dt 中携带2-nt和3-nt缺失（sg1-Atd1d1Dtd1d1，sg2-At-d2d2Dtd3d3）；和 KO-GhRCD1#108 ，分别携带 GhRCD1-At 和 GhRCD1-Dt 中由sgRNA1介导的5-nt和4-nt缺失，以及 GhRCD1-At 和 GhRCD1Dt 中由sgRNA2介导的3-nt和2-nt缺失（sg1Atd5d5Dtd4d4，sg2-Atd3d3Dtd2d2）（图2a）。
正常生长条件下的表型分析显示，所有三个 KO-GhRCD1 株系的幼苗均比WT幼苗表现出更少的侧根 （图2b）， 这表明 GhRCD1 在促进棉花植物生长和发育中发挥着关键作用 。这种差异在Cd2+胁迫下更为明显（图2b和S2）， 表明 KO-GhRCD1 对Cd2+的敏感性更高 。 为了更好地区分GhRCD1突变体的发育表型与Cd2+胁迫表型，研究者采用了额外的形态学和统计测量 （图2c-g）。PI染色显示，与ZM24对照相比，随着 KO-GhRCD1 对Cd2+的耐受性降低， KO-GhRCD1 系Cd2+处理后的细胞死亡率明显增加（图2c，d）。Cd2+处理后，与WTZM24植株相比， ghrcd1 幼苗叶绿体超微结构发生明显畸变，SPAD值相应降低（图2e，f）。
此外， 研究者在ZM24背景下生成了3个独立的过表达系（ OE-3、OE-7和OE-9 ），它们明显上调了GhRCD1，显示出明显增强的Cd2+耐受性 （图S1c-e）。具体来说，在CdCl2处理条件下，这些GhRCD1过表达株系比WT具有更大的生物量和更多的侧根（图S1d，e）。与GhRCD1介导的Cd2+耐受性一致，在CdCl2处理后，野生型和 OE-GhRCD1 植物中的 GhRCD1 表达均被显著诱导，而与野生型相比，在CdCl2处理后， KO-GhRCD1 植物中的表达显著降低（图S1f）。值得注意的是， 与ZM24植物相比， OE-GhRCD1 植物的茎、根和地上部分组织中的Cd2+含量显著较高，而与ZM24植物相比， KO-GhRCD1 植物的茎和根部组织中的Cd2+含量显著较低 （图S1h）。 综上所述，这些发现表明了GhRCD1在改善Cd2+毒性中的功能作用。
图2. GhRCD1 的敲除（KO）降低了陆地棉对Cd2+的耐受性。 （a）已经阐明了CRISPR/Cas9产生的 GhRCD1 突变体的插入/删除（InDel）模式，包括 KO-GhRCD1#35、KO-GhRCD1#86 和 KO-GhRCD1#108 。减号（-）表示在靶位点缺失的核苷酸的数量。（b）用水或CdCl2处理的ZM24和GhRCD1突变体的表型，包括 KO-GhRCD1#35、KO-GhRCD1#86 和 KO-GhRC-D1#108 。比例尺：1cm。（c）PI染色显示用水或CdCl2处理的ZM24和 KO-GhRCD1 的细胞死亡。比例尺：15μm。（d）50μM CdCl2处理后ZM24和 KO-GhRCD1 中不同程度坏死细胞的百分比。以水处理为空白对照。I，仅活细胞的细胞壁被染色。II，轻微损伤的细胞，细胞壁和细胞核均被染色。III，严重受损的细胞，只有死细胞的细胞核被染色，看不到完整的细胞轮廓。（e）50μM Cd2+处理后ZM24和 ghrcd1 叶片细胞叶绿体结构的显微照片。比例尺:0.5μm。（f）50μM CdCl2处理后ZM24、 KO-GhRCD1#35 （ KO-35 ）和 KO-GhRCD1#86 （ KO-86 ）的SPAD值。水处理作为空白对照。在（b-f）中，将14d的LD生长的植物用水或50μM CdCl2处理25天。数值表示平均SD（n=15）。* P ＜0.05；** P ＜0.01；*** P ＜0.001。
3 GhRCD1在体外和体内与GhbHLH12相互作用
由于已知RCD1通过与各种转录因子相互作用来调节氧化应激，并且位于细胞核中（图S1g）， 研究者接下来使用内部棉花应激响应蛋白文库，以GhRCD1为诱饵，对可能的GhRCD1在Cd2+胁迫下的相互作用伙伴进行Y2H筛选。在候选的ghrcd1相互作用蛋白中，研究者根据报道的bHLH家族蛋白在植物Cd2+胁迫应答中的作用，选择了GhbHLH12转录因子进行进一步分析。对GhRCD1和GhbHLH12之间体外相互作用的Y2H测定表明，全序列GhbHLH12表现出自动激活的状态 （图3a）。对GhbHLH12截短变体（包括GhbHLH12N（包含1-300个氨基酸）、GhbHLH12C（包含301-476个氨基酸）和GhbHLH12Q（包含1-202个氨基酸））的进一步Y2H分析表明，发现后者是GhRCD1和GhbHLH12之间相互作用所需的（图3b）。
然后，研究者进行BiFC、GSTPull-down和LCI测定，以检查GhRCD1是否可以与GhbHLH12相互作用。BiFC测定显示，基于黄色荧光蛋白（YFP）信号的激发及其与 N.benthamiana 表皮细胞细胞核中mCherryl标记的核标记H2B的共定位，nYFP-GhRCD1与cYFPGhbHLH12相互作用 （图3c），包括GhRCD1和GhbHLH12的核定位（图S1g和S3a）。 在Pull-down实验中，His标记的GhRCD1蛋白被GST标记的GhbHLH12下拉 ，但不是由GST本身下拉，这进一步 证实了GhRCD1和GhbHLH12之间的体外蛋白质-蛋白质相互作用 （图3d）。此外， LCI测定显示，在被GhRCD1和GhbHLH12共渗透的 N.benthamiana 叶表皮细胞中有强烈的LUC信号 ，但在缺乏任一蛋白质的对照叶子中则没有， 这表明GhRCD1可以与植物中的GhbHLH12相互作用 （图3e）。
图3.GhRCD1在体外和体内与GhbHLH12发生物理相互作用。 （a）酵母双杂交（Y2H）实验表明，在体外，全长GhRCD1与GhbHLH12缺失构建体相互作用。pGADT7-T和pGBKT7-Lam融合序列作为阴性对照，pGADT7-T和pGBKT7-53融合序列作为阳性对照。AD，pGADT7（猎物载体）；BD，pGBDT7（诱饵载体）。（b）用于Y2H测定的GhbHLH12各种片段的位置。GhbHLH12F，全长GhbHLH12，包括bHLH-N和HLH结构域；GhbHLH12N，来自残基1-300个氨基酸的GhbHLH12，包括bHLH-N结构域；GhbHLH12C，来自残基301-476aa的GhbHLH12，包括HLH结构域；GhbHLH12Q，来自残基1-202aa的GhbHLH12，包括bHLH-N结构域。（c）BiFC测定证实了GhRCD1和GhbHLH12在体内的相互作用。nYFP，黄色荧光蛋白（YFP）的N末端；cYFP，YFP的C末端。nYFP与GhRCD1融合，而cYFP与GhbHLH12融合。YFP表现为正交互作用；以H2B-mCherry作为红色荧光蛋白的核定位信号标记。比例尺:50μM。（d）Pull-down测定证明GhbHLH12和GhRCD1之间的体外相互作用。融合的GST-GhbHLH12和His-GhRCD1蛋白用于Pull-down测定。（e）利用LCI法检测了 N.benthamiana 叶片中GhRCD1和GhbHLH12蛋白间的相互作用。荧光素酶（LUC）的N端与GhRCD1融合，LUC的C端与GhbHLH12融合。
4 抑制GhbHLH12增强棉花对Cd2+的耐受性
鉴于早期发现GhRCD1可以在体内和体外与GhbHLH12相互作用， 研究者研究了GhbHLH12是否也参与了棉花对Cd2+胁迫的植物响应 。 研究者首先在ZM24背景中产生 GhbHLH12 过表达和RNAi系 。RT-qPCR分析表明，与野生型相比， GhbHLH12 在 OE-GhbHLH12-1 和 OE-GhbHLH12-3 植物中的表达分别比野生型高约184.4%和120.1%，而其在 GhbHLH12-RNAi-1 和 GhbHLH12-RNAi-5 植物中的表现分别降低了83.0%和84.7%（图S3b，c）。
在正常生长条件下，RNAi和WT幼苗的生物量、侧根平均长度和侧根数量没有显著变化（图4a，b）。然而，在Cd2+处理25天后， GhbHLH12-RNAi 植物的侧根平均长度和生物量显著高于WT。此外，在Cd2+处理后， GhbHLH12-RNAi 系在叶片、茎（尤其是导管组织）和顶端分生组织中也表现出比WT更轻微的坏死表型（图4a，b）。此外，与ZM24相比， GhbHLH12-RNAi 植株的茎、根和茎中Cd2+含量显著升高（图S3d）。PI染色显示，Cd2+处理后，RNAi植物的细胞死亡程度明显低于ZM24（图4c，d）。综上所述， 这些结果表明 bHLH12 敲低导致Cd2+胁迫下根和茎的生长表型发生实质性变化，导致Cd2+耐受性增加。 相反，与野生型相比，Cd2+处理导致 OE-GhbHLH12 株系的叶、茎和顶端分生组织出现更严重的坏死表型（图4a），表明对镉毒性的耐受性降低。在Cd2+胁迫下， OE-GhbHLH12 株系的根、茎和地上部分组织中的Cd2+水平显著低于野生型（图S3d）。PI染色（图4c，d）和DAPI染色（图S4a，b）显示，与WT相比，Cd2+处理后 OE-GhbHLH12 细胞系的细胞死亡率也明显增加。
为了确定GhbHLH12在调节Cd2+耐受性中的功能是否是基因型依赖性的，研究者还使用CRISPR/Cas9系统在百棉1号（BM1）背景中产生了 GhbHLH12 敲除（ KO-GhbHLH12 ）系 （图S3e）。 GhbHLH12 的敲除突变导致Cd2+耐受性增强，叶、茎和顶端分生组织的坏死程度低于BM-1对照植物，在Cd2+处理25天后， KO-GhbHLH12 植物的侧根数量、侧根平均长度和生物量均显著高于BM-1对照植物（图4a，b）。PI染色显示，由于 KO-GhbHLH12 对Cd2+的耐受性更高， KO-GhbHLH12 细胞系Cd2+处理后的细胞死亡率似乎低于BM-1（图4c，d）。
图4. GhbHLH12 负调控陆地棉对Cd2+的耐受性。 （a）Cd2+处理后 RNAi-GhbHLH12 （ RNAi-1 和 RNAi-5 ）、 OEGhbHLH12 （ OE-1 和 OE-3 ）、CRISPR介导的 GhbHLH2 突变体（ KO-6 和 KO-9 ）、BM-1和ZM24的茎部表型。采用水处理作为阴性对照。比例尺：1cm。BM-1（百棉1号），转基因受体产生 GhbHLH12 基因敲除系。ZM24，转基因受体产生 RNAi-GhbHLH12 和 OE-GhbHLH12 细胞系。（b） KO-GhbHLH12 、 RNAi-GhbHLH12 和OE-GhbHLH12系经水或50μM CdCl2处理25d后侧根数、侧根平均长度和生物量的变化。数值表示平均SD（n=15）。* P ＜0.05；** P ＜0.01；*** P ＜0.001。（c）PI染色显示ZM24、BM-1、 KO-GhbHLH12 、 RNAi-GhbHLH12 和 OE-GhbHLH12 系在水和Cd2+处理后的细胞死亡。比例尺：20μm。（d）Cd2+处理后ZM24、 BM-1 、 RNAi-1 、 RNAi-5 、KO-6、KO-9、OE-1、OE-3植株中不同程度坏死细胞的百分比。I，仅活细胞的细胞壁被染色。II，轻微损伤的细胞，细胞壁和细胞核均被染色。III，严重受损的细胞，只有死细胞的细胞核被染色，看不到完整的细胞轮廓。比例尺:20μm。
5 GhRCD1缓解Cd2+处理后GhbHLH12对GhMYB44的转录抑制
为了探索GhbHLH12抑制棉花对Cd2+耐受性的潜在机制，研究者对用50μM CdCl2或水处理的WT幼苗进行了RNA-seq和DAP-seq分析，以确定GhbHLH12调节的下游靶标，并发现GhbHLH2富含 GhMYB44 启动子片段 （表S7）。尽管bHLH和MYB基因都已知参与调节植物的非生物胁迫反应，但每个基因在棉花Cd2+胁迫调控网络中的具体作用仍然未知。 为了探索这种关系，研究者进行了Y1H，使用pAbAi质粒中含有bHLH结合基序（G-box）的区域和GhMYB44启动子突变的bHLH连接位点来检测GhbHLH12和GhMYB4之间可能的DNA-蛋白质相互作用 （图5a）。GhbHLH12可能直接与 GhMYB44 启动子中的bHLH结合基序结合，因为表达pAbAi-GhMYB44和pGADT7-GhbHLH12的酵母细胞在选择性培养基SD/Leu+AbA）上生长和繁殖，而表达突变bHLH结合基序的酵母细胞无法生长（图5b）。此外，EMSA结果显示，His-GhbHLH12融合蛋白可以与含有bHLH结合基序的生物素标记的DNA探针结合，而不能与携带突变基序的探针结合，并且通过添加过量未标记的启动子片段（冷探针）显著减少相互作用（图5c），表明相互作用的特异性。
然后， 研究者使用LUC/REN报告来确定GhbHLH12是否可以直接调节 GhMYB44 的转录 。在 N.benthamiana 叶片中，35Sp:GhbHLH12与 GhMYB44p-LUC 报告基因的共表达导致LUC的表达明显弱于空载体，且LUC表达水平降低的程度与 GhbHLH12 蛋白水平升高相关， 提示GhbHLH12可能是 GhMYB44 的抑制因子。 在加入35Sp:GhRCD1构建体后，与共表达35Sp:GhbHLH12和 GhMYB44p-LUC 的细胞相比，LUC信号显著升高（图5d，e）， 表明GhRCD1可以减轻GhbHLH12对 GhMYB44 的转录抑制 。此外， 研究者进行了EMSA以确定GhRCD1是否影响GhbHLH12的DNA结合能力 。 研究者发现GhRCD1抑制了GhbHLH12与GhMYB44启动子的结合能力，这表明 GhRCD1 可能与 GhbHLH12 竞争，从而拮抗调节 GhMYB44 转录 （图5f）。 为了进一步阐明调控机制，研究者评估了在正常和Cd2+胁迫条件下， GhbHLH12 和 GhRCD1 突变体及其相应过表达系中 GhMYB44 的转录水平 。 使用RT-qPCR分析，研究者发现GhbHLH12作为 GhMYB44 转录的*制剂抑**，而GhRCD1在无Cd2+的环境中增加了它们的转录 。这一发现与研究者的假设一致，即 GhRCD1和GhbHLH12分别是Cd2+耐受性的正调节因子和负调节因子 （图S5a）。有趣的是，暴露于Cd2+显著诱导了WT植物中 GhMYB44 的转录。然而，与野生型植物相比，在GhbHLH12和GhRCD1突变体中，Cd2+对 GhMYB44 的诱导不明显，这表明在Cd2+胁迫下转录调控中存在复杂的相互作用（图S5a）。
图5.GhRCD1与GhbHLH12竞争性拮抗调节 GhMYB44 转录。 （a） GhMYB44 启动子区域示意图。核心作用元件位于 GhMYB44 的第一个ATG的222至278bp的上游区域。（b）酵母单杂交（Y1H）分析显示，GhbHLH12通过bhlh结合基序与 GhMYB44 的启动子区域结合。G-box顺式元件的突变核苷酸序列如图a所示。（c）电泳迁移率转移测定（EMSA）显示GhbHLH12在体外与 GhMYB44 的启动子结合。将GhMYB44启动子中含有结合基序的生物素标记探针与GhbHLH12一起孵育，然后在丙烯酰胺凝胶上对游离和结合的DNA进行分级。（d） GhMYB44 启动子驱动的萤火虫荧光素酶（LUC）报告基因在 N.benthamiana 中的瞬时表达分析表明，GhRCD1抵消了GhbHLH12抑制 GhMYB44 转录的功能。（e）（d）中发光强度的定量分析。（f）EMSA证明，GhRCD1与GhbHLH12竞争，从而拮抗调节GhMYB44转录。LUC活性标准化为enilla荧光素酶（REN）活性（作为内部对照）。数值表示平均SD（n=5）。采用Studentt检验确定显著性水平（*** P ＜0.001）。
6 GhMYB44 增强棉花对Cd2+的耐受性
为了确定 GhMYB44 是否以及如何响应Cd2+胁迫，研究者在ZM24背景中构建了 GhMYB44-OE1/5 转基因系，并通过RT-qPCR验证了 GhMYB44 在这些系中的上调 （图S6a）。 为了进一步剖析由GhMYB44控制的分子回路，研究者设计了两个转基因株系 GhMYB44-SRDX1/6 ，其中GhMYB44与转录抑制因子SRDX融合，SRDX特异性地抑制其下游靶基因的表达，从而破坏由GhMYB44调节的遗传途径，并证实了这些转基因确实在高水平表达 （图S6a）。在Cd2+处理下， GhMYB44-OE1/5 植物表现出比野生型植物更高的Cd2+耐受性，具有比野生型植株更大的生物量、更多和更长的侧根（图6a，b）。同时，Cd2+在这些转基因植物的茎、根和地上部组织中的积累显著高于ZM24的相应组织（图S6b-d）。可以理解的是，PI染色显示，Cd2+处理后， GhMYB44-OE1/5 植株的细胞死亡率明显低于ZM24植株（图6c，d）。
与过表达 GhMYB44 的植物中增加的Cd2+耐受性相反， SRDX-GhMYB44-1/ 6株系表现出比ZM24更高的Cd2+敏感性，如在叶、茎和根中观察到的明显Cd2+毒性所证明的（图6a）。此外， SRDX-GhMYB44-1/6 植物的侧根比WT更短、更少，生物量更低（图6b）。 SRDX-GhMYB44 植株茎、根和地上部的Cd2+浓度均显著低于ZM24，这与Cd2+耐受性降低一致（图S6b-d）。Cd2+处理后的PI染色（图6c、d）和DAPI染色（图6e和S7）表明， SRDX-GhMYB44-1/6 植物的细胞死亡率显著高于ZM24。 这些结果表明， GhMYB44 通过减轻Cd2+对植物生长的抑制作用来增强Cd2+耐受性。
为了阐明GhbHLH12和GhMYB44之间的遗传关系，研究者采用了病毒诱导基因沉默（VIGS）技术。 具体来说，研究者在对照植物BM-1和 KO-GhbHLH12 中沉默了GhMYB44，产生了TRV:00/WT（BM-1）、TRV:00/ KO-GhbHLH12 、TRV: GhMYB44/WT （BM-1）和TRV: GhMYB44/KO-GhbHLH12 植株。当暴露于Cd2+处理时，TRV:GhMYB44植株对Cd2+的敏感性高于WT；在茎中观察到的明显的Cd2+毒性证明了这一点。相反， KO-GhbHLH12 对Cd2+的耐受性增加。然而，TRV: GhMYB44/KO-GhbHLH12 植物表现出比TRV:00/WT（BM-1）更高的对Cd2+的敏感性，类似于TRV: GhMYB44 /WT（BM1）植物。 这些观察结果表明，GhMYB44在GhbHLH12下游发挥作用，在调节Cd2+应激反应中发挥关键作用 （图S8a-d）。
图6. GhMYB44 增加了陆地棉对Cd2+的抗性。 （a）Cd2+处理后 SRDX-GhMYB44 、 OE-GhMYB44 和ZM24的茎部表型。使用水处理作为阴性对照。比例尺：1cm。（b）用Cd2+胁迫或水处理的 DR-1（SRDX-GhMYB44-1） 、 DR-6（SRDX-GhMYB44-6） 、 OE-1（OE-GhMYB44-1） 、 OE-5（OE-GhMYB44-5） 和ZM24的侧根数量、侧根的平均长度和生物量。数值表示平均SD（n=5）。* P ＜0.05；** P ＜0.01。（c）PI染色显示 SRDX-GhMYB44 、 OE-GhMYB4 和ZM24细胞在50μM Cd2+处理或水处理25天后的细胞死亡率。比例尺：20μm。（d）Cd2+处理后 DR-1、DR6、OE-1、OE-5 和ZM24细胞中不同程度坏死的细胞百分比。I，仅活细胞的细胞壁被染色。II，轻微损伤的细胞，细胞壁和细胞核均被染色。III，严重受损的细胞，只有死细胞的细胞核被染色，看不到完整的细胞轮廓。（e）DAPI染色显示用50μM Cd2+胁迫或水处理25天的 DR-1、DR-6 和ZM24植物的细胞死亡。比例尺：20μm。* P ＜0.05；** P ＜0.01；*** P ＜0.001。
7 GhMYB44-GhHMAs 在Cd2+抗性中的转录级联
研究者利用DAP-seq分析了GhMYB44在棉花中的潜在下游靶基因，并进一步研究了该基因改善Cd2+毒性的机制。 结果， 发现了10207个推定的 GhMYB44 结合位点 ，其中大多数位于基因间隔区（61.42%）或启动子（22.31%）区域（图7a、b、S9a、b和S10）。 基因本体论（GO）分析显示，参与应激反应的途径（ GhWRKY13 和 GhWRKY51 ）以及金属离子的结合和转运（ GhHMA1 、 GhHMA2 和 GhHMA5 ）在这些靶基因中显著富集 （图9a-c）。
然后， 研究者探究了GhMYB44是否通过 GhHMA1 和 GhHMA5 在Cd2+转运中发挥调节作用 ，GhHMA1和GhHMA5编码两种已被广泛研究的重金属转运蛋白。 Y1H实验表明，GhMYB44可以特异性结合 GhHMA1 和 GhHMA5 启动子中的G-box（CATGTG）顺式作用元件 ，当G-box基序发生突变时，这种特异性结合被取消（图7c、d和S11a、b）。此外，使用大肠杆菌生产和纯化的His标记的GhMYB44进行DNA结合活性的EMSA分析表明， His-GhMYB44可以与含有 GhHMA1 和 GhHMA5 启动子片段的G-box结合 ， 但不能与携带突变G-box元件的探针结合 （图7e和S11c）。 因此，Gbox顺式作用元件对于GhMYB44与 GhHMA1 和 GhHMA5 启动子的特异性结合是必不可少的。
接下来， 研究者进行瞬时表达实验，测试GhMYB44是否可以直接激活 GhHMA1 和 GhHMA5 在 N.benthamiana 叶片中的转录 （图7f和S11d，e）。35Sp:MYB44效应， GhHMA1p-LUC 报告， GhHMA5p-LUC 报告在 N.benthamiana 叶片中的共浸润导致LUC报告因子显著激活（图7f和S11d、e）。RT-qPCR分析表明，在正常处理下， GhHMA1 和 GhHMA5 的转录在 OE-GhMYB44 和转基因系中显著升高，但在 SRDX-GhMYB44 植物中显著减弱。有趣的是，Cd2+胁迫显著诱导了ZM24植物中 GhHMA1 和 GhHMA5 的转录。然而，与ZM24植物相比， SRDX-GhMYB44 和 KO-bHLH12 中的这种诱导作用显著减弱， 这表明Cd2+诱导的 GhHMA1 和 GhHMA5 的上调在很大程度上取决于GhMYB44和KO-bHLH12的存在和功能 （图7l和S5a-c）。 为了进一步研究GhHMA1和GhHMA5对Cd2+胁迫的生物功能，研究者使用基因沉默（VIGS）技术敲低棉花中 GhHMA1 或 GhHMA5 的表达 。Cd2+处理后， GhHMA1 沉默系和 GhHMA5 沉默系对Cd2+表现出更高的敏感性，与野生型ZM24植物相比，SPAD值和生物量显著较低（图7g-k和S12a-d），这与 SRDX-GhMYB44 植物的表型一致（图6a）。PI和DAPI染色显示，Cd2+处理后， GhHMA1 沉默植株的细胞死亡率明显高于WTZM24植株（图7h和S13a、b）。可以理解的是， GhMYB44- GhHMA1/5 信号级联正向调节棉花对Cd2+的耐受性。
为了阐明GhHMA1和GhMYB44之间的遗传关系，研究者在ZM24和 OE-GhMYB44 植物中沉默了 GhHMA1 。 当暴露于Cd2+处理时， TRV:GhHMA1 植株比ZM24表现出更明显的Cd2+敏感性。值得注意的是，与ZM24对照植株相比， OE-GhMYB44 植株对Cd2+的耐受性增强，叶片、茎和顶端分生组织的坏死症状较轻。然而 OE-GhMYB44TRV:GhHMA1 植物对Cd2+的敏感性增加，反映 TRV:GhHMA1 植物的反应。 这些结果表明， GhHMA1 可能在 GhMYB44 下游发挥作用 （图S14a-d）。
图7.GhMYB44直接结合 GhHMA1 启动子并增强其在陆地棉中的转录。 （a）Venn图显示了GhMYB44结合的靶基因的数量。（b）GhMYB44结合区在棉花基因组中的分布。（c） GhHMA1 的启动子区域示意图。（d）酵母单杂交实验表明，GhMYB44与 GhHMA1 的启动子区域结合。（e）EMSA显示GhMYB44在体外与 GhHMA1 的启动子结合。（f）瞬时表达测定显示GhMYB44直接激活由 GhHMA1 启动子驱动的LUC报告基因的转录。由35S启动子驱动的REN报告基因的表达值用作内部对照。数值表示平均SD（n=5）。*** P ＜0.001。（g）Cd2+处理后TRV:00、 TRV:GhHMA1-1 和 TRV:GhHMA1-5 的茎部表型。采用水处理作为空白对照。（h）DAPI和PI染色显示50μM CdCl2处理后TRV:00、 TRV:GhHMA1-1 和 TRV:GhHMA1-5 的细胞死亡率。（i） HMA1 在TRV:00、 TRV:GhHMA1-1 和 TRV:GhHMA1-5 植物中的相对表达量。（j）50μM CdCl2处理后TRV:00、 TRV:GhHMA1-1 、 TRV:GhHMA1-5 的SPAD值。以水处理为空白对照。数值表示平均值SD（n=20）。* P ＜0.05。（k）Cd2+胁迫下TRV:00、 TRV:GhHMA1-1 和 TRV:GhHMA1-5 的生物量。数值表示平均值SD（n=20）。** P ＜0.01；*** P ＜0.001。（l）RT-qPCR分析显50μM CdCl2处理后ZM24、 SRDX-GhMYB44 和 OE-GhMYB44 系中 GhHMA1 的相对表达。数值表示平均值SD（n=3）。*** P ＜0.001。
8 GhMYB44 和 GhPYL8 协同调节ABA介导的Cd2+耐受
先前的研究表明，外源ABA增强了水稻对Cd2+的耐受性，并且已知一些ABA受体通过与MYB家族蛋白相互作用发挥作用。 为了探索 GhMYB44 是否与ABA受体相互作用介导Cd2+耐受性，研究者进行了Y2H实验来鉴定可能的相互作用蛋白。Y2H测定显示，GhMYB44与GhPYL8（一种经过充分研究的ABA受体）发生物理相互作用 （图8a）。然后， 研究者使用BiFC测定法来验证植物中的这种相互作用 。在 N.benthamiana 叶片中，融合GhMYB44的cYFP与融合GhPYL8的nYFP共转化后，在表皮细胞细胞核中检测到强烈的YFP荧光信号（图8b）。研究者通过体外pull-down测定进一步验证了其与GhPYL8的相互作用（图8c）。
为了研究GhPYL8的生理功能，研究者在ZM24背景下产生了 OE-GhPYL8-1/3/6 转基因系。 Cd2+处理下， OE-GhPYL8-OE 植株对Cd2+的耐受性高于WT对照，生物量和ABA含量均高于WT对照（图8d-f）。PI染色还显示，与WTZM24植物相比， GhPYL8-OE 植物的细胞死亡范围较小（图8g，h）。总之， 这些结果表明GhMYB44可以与GhPYL8相互作用以调节ABA介导的Cd2+耐受性。
图8.GhMYB44在体外和体内与GhPYL8物理相互作用。 将陆地棉 OE-GhPYL8 和ZM24植物暴露于50μM CdCl225天。（a）酵母双杂交（Y2H）测定显示了GhMYB44和GhPYL8的相互作用。（b）BiFC测定显示GhMYB44和GhPYL8在植物中的物理相互作用。（c）Pull-down测定证明了GhPYL8和GhMYB44之间的体外相互作用。融合的GST-GhPYL8和His-GhMYB44蛋白用于Pull-down测定。（d）CdCl2处理后 OE-GhPYL8 （ OE-1、OE-3 和 OE-6 ）和ZM24的茎和根表型。比例尺：1cm。（e）经水和Cd2+胁迫处理的 OE-GhPYL8 （ OE-1、OE-3和OE-6 ）和ZM24的生物量。数值表示平均SD（n=20）* P ＜0.05。（f）水和Cd2+处理后 OE-GhPYL8 植物的ABA含量。数值表示平均值SD（n=20）。** P ＜0.01。（g，h）PI染色显示了CdCl2处理后 OE-GhPYL8 和ZM24植物的细胞死亡率程度。I，仅活细胞的细胞壁被染色。II，轻微损伤的细胞，细胞壁和细胞核均被染色。III，严重受损的细胞，只有死细胞的细胞核被染色，看不到完整的细胞轮廓。水处理作为空白对照。
讨论
由于日益严重的污染危机危及研究者的环境、农业生产和粮食供应，Cd2+的植物修复作为一个研究领域日益受到重视。使用植物激素、螯合化学物质或微生物的外源处理，以及通过调节耐镉基因的遗传改良，只是许多常用方法中的几个例子，这些方法可以提高具有植物修复能力的植物的有效性。尽管研究者对许多植物中Cd2+的植物修复的了解取得了重大进展，但棉花中的调节机制仍不清楚。棉花被广泛用于各种各样的产品，从大量的日用品到医疗用品。考虑到其普遍性和经济重要性，它是用于镉植物修复的主要候选材料。为了提高棉花对污染土壤中Cd2+的吸收和耐受能力，有必要明确棉花对Cd2+耐受的基因和调控途径。 本研究揭示了一个调控级联，即GhRCD1-GhbHLH12-GhMYB44-GhHMA1分子模块（图9），这对Cd2+在棉花中的运输和有效积累至关重要。通过植物育种提高Cd2+植物修复的效果，预示着棉花植物修复的新时代。
图9.棉花中GhRCD1-GhbHLH12-GhMYB44-GhHMA1调节Cd2+耐受性的信号通路模型示意图。 在Cd2+敏感棉花品种中，GhRCD1蛋白含量较低，与GhbHLH12的相互作用较弱，GhbHLH12通过结合 GhMYB44 启动子的G-box，对 GhMYB44 的转录有较强的抑制作用。相反，耐Cd2+棉花品种的GhRCD1含量较高，能与GhbHLH12强相互作用，缓解GhMYB44的转录抑制。这导致 GhMYB44 的表达增加， GhMYB44 可能与ABA受体GhPYL8相互作用，激活重金属转运体 GhHMAs 的转录，从而通过影响Cd2+转运效率来增强Cd2+耐受性。箭头的粗细表示基因表达的强度。虚线表示抑制作用的消除或减弱。蛋白质含量的水平由圆圈的大小表示。
1 GhRCD1通过调控ROS稳态调节Cd2+耐受性
由于其在清除和消除过量ROS方面的作用，RRCD1在维持植物生长和植物对环境胁迫的反应中起双重调节作用。这在rcd1突变体中得到了明确的证明，该突变体由于无法处理过量的ROS而无法对非生物胁迫做出反应或促进植物生长。尽管RCD1的重要性已被广泛记录，但其在植物应对重金属胁迫中的调节作用几乎没有被探索。 然而，Cd2+耐受性和ROS水平之间的拮抗关系已通过Cd2+处理后RCD1的诱导来阐明，以清除过量的ROS。 这种相互作用的另一个主要例子可以在耐Cd2+的油菜中看到，在初始Cd2+应激下，SOD、CAT和POD酶促抗氧化剂的高活性可以维持较低的ROS水平以进行初步解毒。
核蛋白RCD1通过整合叶绿体和线粒体的ROS依赖性信号传导，建立对代谢过程的转录调控。 在本研究中，研究者在棉花中产生了两个GhRCD1突变体，包括T-DNA插入突变体（ rcd1 ）（图1）和CRISPR敲除突变体（ KO-GhRCD1 ）（图2），这两个突变体都被发现对Cd2+胁迫敏感，并且在正常或Cd2+胁迫条件下都表现出抑制生长的表型。 在正常条件和Cd2+胁迫下， rcd1 突变体的根尖ROS积累比WT更明显（图S15a，b），导致根、茎和茎尖的生长抑制和严重的重金属毒性表型， 这证实了GhRCD1通过调节细胞ROS浓度对Cd2+胁迫作出反应的说法 。维持氧化还原稳态需要RCD1来调节ROS诱导的细胞死亡，进而控制防御和生长之间的权衡。
2 GhRCD1与GhbHLH12相互作用以响应Cd2+胁迫
几项研究表明，RCD1与多种转录因子相互作用，包括拟南芥中的SOS1、ANAC013和ANAC017，以及菊花中的CmBBX8蛋白，以介导植物发育和应激反应。 在本研究中，研究者使用Y2H筛选来确定GhbHLH12与GhRCD1相互作用，并通过GST pull down、BiFC和LCI试验验证了这一点，从而证实了GhRCD1-GhbHLH12复合物调节棉花对Cd2+的耐受性的假设（图3）。 此外，GhbHLH12的bHLH结构域是GhbHLH12和GhRCD1相互作用所必需的。bHLH蛋白确实在调节Cd2+耐受性中起着关键作用。先前的研究已经揭示了不同植物中与抗逆性相关的基因，为这项研究提供了基础。例如，在拟南芥中， bHLH38 和 bHLH101 表达的增加促进了Cd2+的吸收和积累，FIT与AtbHLH38或AtbHLH39的共过表达通过增强茎部铁稳态和增加根中镉的吸收来增强Cd2+耐受性。 bhlh104 突变体对Cd2+胁迫表现出敏感性，而过表达 bHLH104 的植物对Cd2+的耐受性增强。与这些研究一致， 在本研究中，研究者证明了 RNAi-GhbHLH12 和 CRISPR-KO-GhbHLH12 植物对Cd2+的耐受性显著增加（图4），而过表达 GhbHLH12 会导致植物对Cd2+胁迫的易感性增加，这表明GhbHLH12和GhRCD1在植物对Cd2+胁迫的反应中具有相反的作用
通常，bHLHs通过二聚化调节下游靶标。两种bHLH蛋白GhTCEE1和GhTCE1形成异源二聚体，促进 GhTCE1 的活化能力，而bHLH蛋白FIT与bHLH38、bHLH39、bHLH100或bHLH101形成异二聚体，以响应Cd2+胁迫而激活 FRO2 和 IRT1 。需要进一步的研究来确定确定与bHLH12相互作用并控制下游靶基因表达以响应Cd2+胁迫的特定bHLH蛋白。
3 GhMYB44-GhHMAs代表了棉花对Cd2+耐受的一个新的转录级联
植物修复是一种很有前途的、环境友好的、经济有效的解决土壤重金属污染的方法。这一方法的成功实施取决于对耐受基因的探索和通过遗传改良开发Cd2+修复效率。 在本研究中，研究者发现 GhMYB44 是GhbHLH12的下游靶点，而GhRCD1直接调控GhbHLH12。 OE-GhMYB44 系的根、茎和叶Cd2+积累显著高于野生型植物。相反，在SRDX系中，Cd2+积累减少，这表明MYB44在Cd2+吸收和积累中发挥了有益作用。 与WT相比， GhMYB44 的过表达不仅增强了Cd2+在根和地上部的吸收和积累，而且表现出高水平的Cd2+耐受性，没有Cd2+毒性症状 ， 并显著增加了地上和地下生物量 。这些转基因植物对Cd2+吸收能力的提高和积极的特性使它们适合在Cd2+受影响的地区生长，并从污染土壤中去除累积的Cd2+。
许多植物已经开发出复杂的策略来保护其细胞免受Cd2+的毒性，例如在液泡中螯合Cd2+或在胞质溶胶中捕获游离Cd2+的能力。金属转运蛋白，包括IRT1、NRAMP1和HMA，用于其中几种Cd2+响应机制。例如，重金属ATP酶3（OsHMA3）位于根的液泡膜中，通过将Cd2+隔离到根液泡中来防止长距离Cd2+易位。在伴矿景天中，与WT植株相比，SpHMA1缺陷植株叶绿体中Cd2+的积累量显著增加，阻碍了光系统II的活性。进一步的研究表明，SpHMA1在叶绿体中起到叶绿体Cd2+输出器的作用，从而阻止Cd2+的积累并保护光合作用。同样，在水稻中，将Cd2+从中柱鞘细胞直接装载到木质部导管中是OsHMA2介导这种长距离Cd2+易位的另一种机制。 在本研究中，研究者发现与WT植物相比， GhMYB44 过表达植物在根、茎和芽中积累了更多的Cd2+，但没有明显的生长抑制。研究者推测这是因为在 OE-GhMYB44 植物中升高的GhHMA3介导了增加的Cd2+转移到液泡中。此外，Cd2+转运基因如GhHMA2和GhHMA44被上调，增强Cd2+从根部到地上部的转运，从而增强植物对Cd2+胁迫的抵抗力。同样，通过用GhMYB44的DAP-seq数据筛选几个GhHMA相关基因，研究者证实它可以直接结合HMAS启动子并触发其转录。 需要进一步的研究来确定GhMYB44-GhHMAs信号通路如何调节Cd2+转运以提高棉花对Cd2+的耐受性。
4 GhPYL8通过募集ABA参与Cd2+耐受
植物激素对调节植物生长发育和抵御重金属胁迫至关重要。脱落酸（ABA）是最具特征的植物激素之一，在Cd2+胁迫反应中是不可或缺的。在水稻中，Cd2+胁迫显著上调 OsNCED4 和 OsNCED5 ，这两个基因已知参与ABA的生物合成。与此相一致的是，有文献表明，在拟南芥中，ABA缺乏突变体（aba-3，aba-4，nced3）和ABA不敏感突变体（abi2-1，abi3-1）更容易受到Cd2+胁迫，进一步证明了ABA与Cd2+耐受性的相关性。一项对东南景天的研究表明，在Cd2+胁迫下，参与ABA生物合成的基因（ SaABA2 和 SaNCED ）上调，导致内源ABA增加。这些基因反过来调节木栓质相关基因（ SaCYP86A1、SaGPAT5 和 SaKCS20 ）的活性，这导致根内胚层中凯氏带和木栓层的沉积增加。ABA浓度越高的植物对非生物胁迫的抵抗力越强。在水稻中，外源ABA的施用降低了Cd2+的转运速率和积累，从而增强了Cd2+的耐受性。在拟南芥中，ABI5通过与Cd2+诱导的MYB49相互作用调节ABA介导的Cd2+摄取。当植物受到微量金属的胁迫时，植物组织中会产生更多的ABA，这表明ABA在减轻这些元素的有害影响方面发挥了作用。与这些发现一致， 研究者发现Cd2+胁迫后， PYL8 过表达系的ABA含量显著高于ZM24（图8）。此外，研究者发现GhMYB44与GhPYL8相互作用，在棉花中募集ABA，从而增加Cd2+抗性（图8）。 ABA受体PYL8和PYL9通过应激诱导停滞后LR分生组织的恢复促进MYB44和MYB77的表达，从而控制侧根的生长。有趣的是， 本研究结果表明，MYB44通过直接调节HMAs的转录来改善Cd2+的转运，从而影响植物的Cd2+胁迫反应 。 由于GhMYB44与GhPYL8相互作用，本研究结果表明，GhMYB44-GhHMAs和PYL8介导的ABA调节模块在介导Cd2+耐受性方面存在因果关系（图9）。PYL8-MYB44不仅能促进侧根恢复，还能调节镉胁迫下离子转运蛋白（HMAs）的表达。 特别是，已经证明，这些基因中的许多在不同物种中都保留了其原始功能。了解在棉花中观察到的GhRCD1-GhbHLH12-GhMYB44-GhHMA1调控回路是否也在其他作物中发挥作用，以及如何对其成分进行修饰以成功减少土壤中的重金属污染，将是非常有用的。